Versione 3 del 16/05/2003
TRIGR PROJECT
TRIAL TO REDUCE INSULIN-DEPENDENT DIABETES IN GENETICALLY AT RISK

Definizione
(TRIGR) TRIAL DI PREVENZIONE DEL DIABETE DI TIPO 1 IN NEONATI PARENTI DI 1° GRADO DI PAZIENTI DIABETICI.
Il Progetto TRIGR è uno studio internazionale, multicentrico, randomizzato in doppio cieco che prevede il reclutamento di 2800 neonati nel mondo (in Italia circa 60 di cui la metà in Sardegna).
Il progetto si basa sull’ipotesi che il latte vaccino somministrato nei primi mesi di vita sarebbe diabetogeno. Prevede due gruppi di bambini, uno che prende esclusivamente latte a base di idrolizzato di caseina e uno che assumerà latte convenzionale. Il primo gruppo di bambini dovrebbe avere una diminuzione dell’insorgenza degli anticorpi associati al diabete di tipo 1 rispetto al gruppo di controllo. La seconda ipotesi è che il gruppo svezzato con l’idrolizzato di caseina abbia una riduzione dell’incidenza di diabete di tipo 1. Se l’ipotesi risultasse corretta, la prevenzione di una parte dei casi di diabete tipo 1 e la conseguente riduzione di morbilità, mortalità e costi ad esso correlati sarebbe un obiettivo proponibile ed in seguito facilmente applicabile alla popolazione generale da cui originano il 90% dei casi di diabete tipo 1.
   
Introduzione/ dati scientifici
Il diabete mellito tipo 1 è una della principali malattie croniche dell’infanzia. La Sardegna presenta una delle più alte incidenze al mondo di tale patologia (38 nuovi casi ogni 100.000 bambini fino a 15 anni ogni anno).
Le conseguenze e il costo sociale del diabete tipo 1 sono notevoli, non solo da un punto di vista economico e sociale, ma anche per quanto riguarda la qualità di vita. Ad esempio complicanze croniche microvascolari (retinopatia, nefropatia, neuropatia) e macrovascolari (ictus, IMA, vasculopatie periferiche) si manifestano in una considerevole proporzione di pazienti e sono dipendenti dalla durata di malattia, che è tanto più elevata quanto più giovane è stata l’età di insorgenza. Esse sono causa di invalidità. Da ciò si intuisce che la prevenzione del diabete tipo 1 anche solo in una parte dei soggetti che svilupperanno la patologia, porterà a notevoli benefici socioeconomici.
Il diabete tipo 1 è una malattia autoimmune, di cui tutt’oggi non è noto il/i fattore/i scatenante/i. La malattia è causata della distruzione delle cellule pancreatiche specializzate nella produzione di insulina da parte dei linfociti T. Si ritiene che un insieme di fattori genetici ed ambientali contribuiscano alla genesi della malattia, in particolare, il corredo genico dell’individuo renderebbe più o meno probabile lo scatenamento del processo autoimmune nel momento in cui l’individuo dovesse entrare in contatto con il/i fattore/i eziologico/i ambientale/i.
L’attacco autoimmune contro le beta cellule dell’insula pancreatica è reso manifesto dalla comparsa nel sangue periferico di anticorpi diretti contro le beta cellule stesse (ICA, GADA, IA-2, IAA), che pur non essendo essi stessi direttamente patogenetici (la distruzione è operata da linfociti T), rappresentano importanti marcatori della fase di pre-diabete e consentono di individuare un parte i soggetti che svilupperanno la malattia. La presenza di aplotipi HLA di rischio in associazione con anticorpi anti insula pancreatica aumenta notevolmente il valore predittivo di tutti i markers.
Fattori genetici
Il ruolo della genetica nel diabete tipo 1 è illustrato dai risultati degli studi familiari e degli studi sui marcatori genetici. I familiari di primo grado di diabetici hanno un rischio aumentato di contrarre la malattia, variabile secondo la popolazione studiata. I fratelli hanno un rischio del 6-8% che attiva al 12-19% se condividono con il fratello affetto lo stesso aplotipo HLA, e i gemelli identici hanno una concordanza di diabete del 20-30% ancora maggiore se presentano HLA di alto rischio. I nati da madre diabetica hanno un rischio di contrarre la malattia del 1.5-2.5% mentre nei nati da padre diabetico tale rischio arriva al 3-6%.
Sono stati individuati circa 20 geni in qualche misura associati al diabete tipo 1, ma solo i geni HLA di classe seconda e, in qualche misura la regione del promoter del gene dell’insulina sul cromosoma 11, sono importanti e sono dotati di elevato valore predittivo sia in senso di sviluppo della malattia che di protezione.
Numerosi sono i fattori ambientali che sono stati di volta in volta chiamati in causa nella patogenesi del diabete, da studi ecologici di associazione con la patologia e, meno frequentemente, da studi sul possibile meccanismo d’azione condotti per lo più su animali. Tra questi fattori ricordiamo:
  • Virus
  • Nitriti e nitrati
  • Tossine
  • Vitamine
  • Glutine ed altre proteine vegetali
  • Latte vaccino
Le prime evidenze di un possibile ruolo diabetogeno delle proteine del latte vaccino derivano da studi condotti nei primi anni Ottanta su animali predisposti allo sviluppo di tale patologia (topi NOD e ratti BB). Queste indagini hanno evidenziato una minore incidenza di diabete negli animali alimentati con dieta priva di proteine del latte bovino. Tutti gli studi concludono concordemente in questo senso.
Studi ecologici e studi caso-controllo hanno proposto tale ruolo anche nell’uomo. E’ stato infatti evidenziato che i paesi con dieta a basso contenuto di proteine del latte o con basso consumo di latte hanno anche una bassa incidenza di diabete tipo 1. Inoltre alcuni studi hanno rilevato una correlazione inversa tra incidenza di diabete tipo 1 e allattamento al seno, il quale risulterebbe protettivo nei confronti di tale patologia. Parrebbe quindi che una precoce esposizione alle proteine del latte vaccino risulti diabetogena. Non tutti gli studi tuttavia sono concordi e problemi di differente metodologia applicata in tali studi retrospettivi non ne consente la comparazione.
I motivi di questo non sono noti. Il meccanismo invocato è che la somministrazione precoce di latte vaccino intero ad individui predisposti induca una risposta immunitaria nei confronti di proteine del latte vaccino cross reagenti con antigeni espressi sulle beta cellule. La predisposizione sarebbe evidenziabile dalla presenza di alcuni specifici aplotipi HLA che consentirebbero una particolare presentazione di epitopi delle proteine del latte vaccino attivando la reazione autoimmune. A supporto di ciò starebbe il rilievo di anticorpi contro proteine del latte nel siero di pazienti diabetici di nuova diagnosi. Altri meccanismi che spiegherebbero la protezione nei confronti del diabete operata dalla dieta priva di proteine del latte vaccino sarebbero: interferenza sulla immunità a livello di mucose, sensibilizzazione dei T linfociti alle proteine del latte o verso la insulina bovine, produzione di citochine proinfiammatorie, ed aumento dipendente dalla dieta di espressione di proteine di adesione cellulare. Altre possibili spiegazioni della correlazione tra latte e diabete potrebbero essere rappresentati da: alterazione della tolleranza per via orale; le proteine del latte vaccino potrebbero essere markers di altri fenomeni/agenti; l’allattamento al seno potrebbe essere protettivo per lo sviluppo di diabete perché fornirebbe protezione immune da infezioni virali.
Il presente studio si propone di verificare il possibile ruolo della precoce esposizione alle proteine del latte vaccino in soggetti geneticamente predisposti.
La pianificazione dello studio TRIGR è iniziata nel 1988 ad opera del prof JM Martin di Toronto e proseguti nel corso degli anni fino a giungere al protocollo attuale.
Per testare l’ipotesi della diabetogenicità delle proteine del latte e della fattibilità di uno studio di intervento in tal senso, sono stati condotti diversi studi dal gruppo.
Il primo di questi è stato condotto sui topi NOD ed ha mostrato che negli animali non esposti alle proteine del latte si ava una protezione allo sviluppo del diabete superiore al 90%.
E’ poi stato condotto un primo studio pilota di fattibilità su 20 neonati in Finlandia con l’obiettivo di valutare gli aspetti logistici, umani e la salute dei neonati sottoposti alla dieta modificata; i riusltati sono stati ottimi sotto tutti i punti di vista.
Successivamente è stato quindi condotto un secondo pilot study. Lo studio aveva coinvolto in questo caso 15 centri in Finlandia, uno in Svezia, due in Estonia e uno in Ungheria oltre alla partecipazione della Sardegna (ospedale Brotzu) per alcuni studi per la valutazione del rischio genetico e della possibilità di ampliare il network anche a quest’area (spedizioni, logistica etc). Il pilot study aveva lo stesso disegno sperimentale dello studio che si propone oggi. Sono stati reclutati 521 neonati dei quali 476 sono stati tipizzati geneticamente di cui 208 sono risultati ad alto rischio e randomizzati nei due gruppi di trattamento. I neonati sono stati seguiti per 3 anni. In tale periodo di osservazione si sono utilizzati dei markers surrogati del diabete e cioè la comparsa di anticorpi anti insula pancreatica che caratterizzano la fase preclinica del diabete tipo 1 e che sono espressione dell’aggressione autoimmune verso le beta-cellule pancreatiche. Nel gruppo trattato con idrolizzato di caseina si è avuta una prevalenza di autoanticorpi anti insula pancreatica (7/99=7.1%) significativamente inferiore rispetto al gruppo normalmente esposto alle proteine del latte (17/109=15.6%) (p=0.04). Si è avuta quindi una riduzione della prevalenza di autoanticorpi anti insula tra 44 e 66% nel gruppo trattato rispetto al controllo. Anche il numero di diabetici nel gruppo trattato è risultato inferiore (4 verso 2 casi) sebbene i piccoli numeri non consentano di raggiungere una significatività statistica.
Un aspetto importante emerso da questo studio pilota, è rappresentato inoltre dalla fattibilità dello studio in sè, intesa come aderenza delle famiglie alle restrizioni dietetiche previste, possibilità di attuare praticamente lo screening sui neonati secondo le modalità previste dal protocollo, possibilità di attuare il follow up secondo le modalità stabilite. Sono stati inoltre individuati i laboratori di riferimento adatti per lo studio e istruito il personale di coordinamento. Inoltre la crescita e lo sviluppo psico-fisico dei bambini trattati non sono stati diversi dal gruppo di controllo e dalla popolazione generale, mostrando la sicurezza dello studio di intervento per la salute dei bambini. Questo potrebbe non essere un aspetto secondario anche in termini patogenetici, dato che il precoce aumento di peso e il pattern di crescita neonatale sono stati correlati con l’insorgenza del diabete tipo 1. Infine il pilot study è servito per fornire i dati necessari al calcolo della numerosità campionaria sufficiente per raggiungere dei risultati statisticamente validi.
   
Obiettivi dello studio
E’ uno studio di prevenzione primaria, randomizzato, in doppio cieco, che ha come finalità l’analisi delle differenze tra il gruppo normalmente esposto alle proteine del latte vaccino e il gruppo trattato con idrolizzato proteico, in termini di insorgenza di diabete Tipo 1 o di comparsa di anticorpi anti insula pancreatica. Entrambi i gruppi saranno costituiti da neonati geneticamente ad alto rischio di contrarre il diabete tipo 1 (familiari di primo gradi di diabetici con particolari aplotipi HLA di alto rischio).
Più dettagliatamente:
Scopo principale:
  • abolizione delle proteine del latte vaccino nei primi 6-8 mesi di vita prevenga la comparsa di diabete tipo 1 o di anticorpi anti insula pancreatica (markers surrogati) in neonati ad alto rischio genetico.
Nell’arco temporale proposto nel presente protocollo difficilmente si potrà dare una risposta soddisfacente in termini di sviluppo di diabete nella coorte in studio, tuttavia le evidenze relative al ruolo svolto dai markers anticorpali consentono di ritenere che qualsiasi intervento che impedisca la distruzione betacellulare deve inevitabilmente impedire l’attacco autoimmune e quindi la formazione di autoanticorpi che costituiscono un importante marker surrogato del danno. Per tale motivo è giustificato assumere come scopo dello studio la riduzione della comparsa degli autoanticorpi anti insula pancreatica.
Scopi accessori o secondari:
In generale tali scopi sono rappresentati dalla comprensione della storia naturale del diabete tipo 1 a partire dalla fase di prediabete e dalla determinazione della relazione tra autoimmunità anti beta-cellula e risposta immune contro le proteine del latte vaccino. In dettaglio:
  • Valutare quale antigene della beta-cellula pancreatica sia predominante nello scatenare la risposta autoimmune
  • Valutare quale anticorpo anti beta-cellula compare per primo nella fase di prediabete
  • Valutare quale sia la relazione tra risposta umorale e cellulare nelle varie fasi del prediabete
  • Valutare quale sia l’effetto dell’intervento dietetico nello sviluppo di anticorpi e T cellule reattive contro le proteine del latte vaccino
  • Valutare quale sia la relazione tra risposta immune contro le beta cellule e contro le proteine del latte vaccino
Questo è il primo studio di prevenzione primaria del diabete tipo 1 mai proposto. Infatti tutti i trials di prevenzione del diabete sono stati fin’ora condotti su soggetti a rischio in quanto presentano anticorpi contro la beta cellula, quindi in una fase già avanzata dell’attacco autoimmune a queste cellule. Il fallimento della strategia preventiva di tali studi sarebbe da imputare proprio al momento tardivo di intervento. Nel presente studio, invece, si applicherà la ipotetica strategia preventiva in soggetti che presentano un elevato rischio genetico di sviluppare il diabete (familiari di primo grado con aplotipi HLA di elevato rischio), ma non hanno ancora sviluppato l’insulite autoimmune.
   
Calcolo della numerosità campionaria
La dimensione del campione da randomizzare è stata calcolata in base ad alcuni assunti sul potere dello studio, ad evidenze di letteratura sulla frequenza di comparsa di autoanticorpi anti insula e di diabete tipo 1 nei familiari di individui diabetici ed ai risultati di aderenza allo studio ottenuti nel pilot study condotto in Finlandia. Tali assunti si possono così riassumere:
  • potere dello studio 80%
  • intervalli di confidenza 95%
  • riduzione attesa della incidenza di diabete tipo 1 a 10 aa : 40%
In base a questo, per poter ottenere risultati statisticamente validi, sarà necessario randomizzare 2800 neonati.
Per raggiungere tale numero sarà necessario contattare in tutto il mondo almeno 8000 famiglie, assumendo:
  • frequenza dei genotipi a rischio nella popolazione studiata: 45%
  • tasso di accettazione dello studio e firma del consenso: 85%
  • tasso di esclusione in base ai criteri di esclusione: 8,5%
  • tasso di drop out: 20%
  • allattamento esclusivo fino ai 6 mesi: 10%
Per raggiungere tale numerosità in un tempo ragionevole è necessaria la collaborazione di numerosi centri in tutto il mondo. Per tale motivo si è costituito per tale scopo un gruppo di studio multicentrico che comprende 3 aree del mondo (Europa, America ed Australia).
   
Organizzazione ed amministrazione del TRIGR
Lo studio verrà condotto da un gruppo di studio multi-nazionale suddiviso in tre grandi aree geografiche (Europa, Canada, USA). Tale suddivisione è dettata da motivi pratici inerenti il reclutamento e la gestione pratica del progetto.
   
Centri internazionali coinvolti e coordinamento
Visto il successo del pilot study condotto in Finlandia, il coordinamento dello studio a livello internazionale verrà effettuato dal prof. Hans Akerblom Università di Helsinki, Ospedale pediatrico di Helsinki - Finlandia.
I centri coinvolti alla sperimentazione sono:
EUROPA
  • Finlandia 16 ospedali
  • Estonia 2 ospedali
  • Francia vari ospedali
  • Germania 2 ospedali
  • Ungheria 1 ospedale
  • Italia continentale (Lazio) 5 ospedali
 
  • Sardegna 1 ospedale
 
  • Olanda 30 ospedali
 
  • Polonia 3 ospedali
 
  • Spagna (Madrid) 1 ospedale
 
  • Spagna (Bilbao) 6 ospedali
 
  • Svezia 10 ospedali
 
  • Svizzera 1 ospedale
 
NORD AMERICA
 
  • Canada 14 ospedali
 
  • USA 6 ospedali
 
AUSTRALIA
 
  • Parramatta 3 ospedali
 
Per quanto concerne la sperimentazione all’interno dell’Azienda Ospedaliera Brotzu, verrà condotta sotto la responsabilità del coordinatore locale dr Marco Songini, Primario della Unità Operativa di Diabetologia della medesima Azienda Ospedaliera.
Verranno coinvolte le seguenti struttura dell’Azienda Ospedaliera Brotzu
 
  • Diabetologia
 
  • Ostetricia
 
  • Neonatologia/nido
 
Persone coinvolte nella sperimentazione
 
  • Dr Marco Songini (diabetologia)
 
  • Dr.ssa Anna Casu (diabetologia)
 
  • Dr.ssa Maria Battistina Carboni (diabetologia)
 
  • Dr.ssa Luciana Pibiri (neonatologia)
 
  • Dr. Paolo Masile (neonatologia)
 
  • Dr. Raffaele Puddu (ginecologia)
 
  • Dr.ssa Esmeralda Loi (ginecologia)
 
  • Dr. Franco Medda (ginecologia)
 
 
Protocollo di intervento
   
Criteri di inclusione dei soggetti
Perché un soggetto possa essere reclutato per lo studio deve soddisfare i seguenti criteri:
  • Neonato di madre, padre o fratello/sorella affetti da diabete di tipo 1 secondo i cirteri del WHO
  • Firma del consenso da parte dei genitori o del tutore
Il soggetto viene poi randomizzato in uno dei due bracci dello studio se soddisfa inoltre il seguente criterio:
  • Il genotipo del neonato deve avere alleli HLA diabetogeni, ma non alleli HLA protettivi definiti sulla base di criteri noti di suscettibilità o protezione.
  • Il neonato non deve aver assunto proteine del latte vaccino prima della randomizzazione
Criteri di esclusione
  • Incapacità dei genitori a capire lo studio e le sue istruzioni o, in generale, a prendere parte allo studio per impedimenti di qualsiasi natura
  • Riluttanza/impossibilità di alimentare il neonato con prodotti contenenti latte vaccino per qualsiasi ragione (es. religiosa, culturale ecc.)
  • Rifiuto della famiglia o del medico curante di sostenere la randomizzazione e l’adesione al protocollo
  • Presenza di gravi malattie quali anomalie cromosomiche, malformazioni congenite, difficoltà respiratorie, deficit enzimatici, ecc.
  • Età gestazionale minore di 35 settimane
  • Neonati che abbiano assunto prodotti a base di latte vaccino prima della randomizzazione
  • Inaccessibilità ad uno dei centri di ricerca
  • Gravidanza/parto gemellare
  • Fratello/sorella che già prende parte allo studio TRIGR
  • Il bambino ha più di 7 giorni al momento della randomizzazione
  • Non è stato raccolto il campione per l’analisi genetica prima dell’ottavo giorno di vita del bambino
   
Criteri per il ritiro dei soggetti (cioè interruzione del trattamento con il prodotto in sperimentazione/trattamento sperimentale)
Qualora durante il corso di questo studio una strategia alternativa dovesse risultare più efficace, le famiglie verranno informate e ne potranno fare uso.
   
Reclutamento
Per reclutamento si intende la proposta della partecipazione della famiglia allo studio TRIGR e la accettazione dello studio da parte della famiglia stessa con firma del consenso informato. Il reclutamento potrà avvenire prima della nascita o al momento del parto. In quest’ultimo caso il prelievo per l’analisi genetica verrà effettuato su blood spot e non su prelievo dal cordone ombelicale, dato che non si è avuta la possibilità di spiegare adeguatamente alla madre le procedure dello studio prima del parto, e non è quindi disponibile il consenso informato per il prelievo di sangue cordale.
Il reclutamento verrà condotto durante i primi 2 anni dello studio nei centri partecipanti. Il reclutamento proseguirà oltre i 2 anni qualora non si raggiungesse in tale intervallo di tempo la numerosità necessaria. Si ipotizza che circa la metà dei soggetti verrà reclutata in Europa.
In Sardegna si ritiene sia possibile randomizzare un totale di 30 neonati nei 2 anni. Tale stima deriva da una precedente indagine condotta nella neonatologia dell’Ospedale Brotzu dal dr Masile e collaboratori. Tale studio mirava ad indagare l’outcome dei neonati da madre diabetica. In base a questa indagine è risultato che nell’Ospedale Brotzu nascono ogni anno 15-16 bambini da madre affetta da diabete tipo 1. Ipotizzando che altrettanti nascano da padre diabetico, senza tenere conto dei nati con un fratello/sorella già diabetico, una stima per difetto fornirebbe 30 possibili neonati da screenare ogni anno. Si ipotizza che il 45% di questi presenti gli aplotipi di alto rischio e potrebbe teoricamente essere randomizzato in uno dei due bracci dello studio, in totale quindi 30 neonati nell’arco dei 2 anni.
Viste le condizioni di reclutamento si ritiene che verranno reclutati un ugual numero di maschi e di femmine. Vista la prevalenza degli aplotipi di rischio è verosimile che la coorte sarà costituita prevalentemente da soggetti di etnia caucasica.
Per facilitare il reclutamento e limitare la possibilità di assunzione di proteine del latte vaccino da parte dei neonati eleggibili per lo studio, verrà posta la massima cura nell’identificare le famiglie da includere prima della nascita del neonato. Al momento del contatto verranno fornite informazioni dettagliate sia verbali che scritte sullo studio e verrà fatto firmare ai genitori un modulo di consenso informato (v.allegato). Il neonato parteciperà allo studio qualora abbia i requisiti richiesti dai criteri di inclusione. Le famiglie potranno essere inserite nello studio anche direttamente al momento della nascita del bambino nel reparto di ostetricia e di neonatologia.
Durante la gravidanza le madri con diabete tipo 1 verranno individuate presso il servizio di diabetologia e il reparto di ostetricia-gincologia. I padri e i fratelli affetti da diabete tipo 1 verranno identificati attraverso i servizi di diabetologia (pediatrico e dell’adulto) e mediante anamnesi familiare delle madri in occasione delle visite di controllo effettuate durante la gravidanza presso il reparto di ostetricia-ginecologia e neonatologia.
Sarà necessario vista la complessa organizzazione dello studio che le madri partoriscano presso l’ospedale Brotzu, affinché i neonati possano essere tempestivamente screenati per genetica di rischio e allattati secondo le procedure previste.
Per favorire la partecipazione, lo studio sarà inoltre pubblicizzato all’interno dell’ospedale con pannelli illustrativi e volantini, e anche sui media, sul web e tramite le associazioni dei diabetici.
Al momento del reclutamento sarà compilato un modulo di reclutamento anonimo ed un modulo di registrazione per le famiglie che parteciperanno allo studio. Su questo modulo saranno contenuti i dati sensibili del soggetto e della famiglia. Tali dati rimarranno archiviati esclusivamente presso il centro locale dell’Ospedale Brotzu. Verrà attribuito un codice al soggetto che verrà utilizzato per il trasferimento dei dati al centro di elaborazione internazionale (Helsinki), che avverrà quindi in forma totalmente anonima attraverso il database protetto tramite sito web.
Randomizzazione
Al momento della nascita, il neonato che soddisfa i criteri di inclusione i cui genitori abbiano firmato il consenso informato alla partecipazione allo studio, verrà sottoposto a prelievo di sangue dal cordone ombelicale per la ricerca dei marcatori genetici di alto rischio per il diabete tipo 1. Qualora presenti uno degli aplotipi HLA di alto rischio come previsto dallo studio (v. metodiche applicate – screening genetico) verrà randomizzato, cioè assegnato ad uno dei 2 gruppi di trattamento: con formula normale a base di latte vaccino, con formula a base di idrolizzato di proteine del latte. La randomizazione verrà effettuata centralmente tramite sito web accessibile con password solo agli sperimentatori. Qualora fosse impossibile l’allattamento al seno da parte della madre, i neonati assumeranno la formula di studio secondo quanto stabilito dalla randomizzazione. Tutti i soggetti che necessitino di allattamento prima della randomizzazione riceveranno soluzione glucosata o formula a base di idrolizzato di caseina (Nutramigen, Mead Johnson). I neonati inseriti nello studio saranno identificati in modo chiaro in modo da evitare erronea somministrazione di latte o formula non consentita dal protocollo durante il ricovero nel servizio di neonatologia.
Il codice di randomizzazione verrà aperto quando l’ultimo neonato dello studio compirà 6 anni.
Prelievi di sangue cordale
Un campione e di sangue cordale (2-3 ml) verrà prelevato per effettuare l’analisi genetica sui neonati; alternativamente tale analisi potrà essere effettuata anche su sangue capillare, in particolare in quei casi in cui la randomizzazione avvenga al momento del parto o subito dopo la nascita. Il campione andrà raccolto il più presto possibile, ma comunque dopo la firma del consenso informato da parte dei genitori ed entro 7 giorni dalla nascita.
Il campione di sangue cordonale o di sangue capillare verrà inviato mediante corriere al centro di tipizzazione genetica in Finlandia, che provvederà a valutare il rischio genetico e a comunicarlo entro 5-7 gg al centro periferico che ha inviato il campione. Solo i soggetti ad alto rischio genetico proseguiranno nello studio mentre le altre famiglie (55%) non proseguiranno e verranno informate del basso rischio genetico del neonato di contrarre il diabete (sottolineando tuttavia che tale rischio per quanto basso non è nullo e che il neonato potrebbe nel futuro comunque sviluppare il diabete tipo 1 anche se non soddisfa i criteri di inclusione).
Qualora fosse disponibile sangue cordale in eccesso rispetto a quello necessario per lo screening genetico, verrà sierato e freezato a –20°C per la futura analisi dei marcatori anticorpali.
Follow up clinico, sierologico e metabolico
I bambini saranno visitati all’età di 3, 6, 9, 12, 18 e 24 mesi e a 3, 4, 5, 6 e 10 anni e saranno sottoposti a dei prelievi di sangue per gli esami sierologici (2 ml entro il 2 anno di vita, 5 ml successivamente). Con l’esame a 3 e 6 mesi si valuterà anche la compliance del soggetto alla dieta, misurando i livelli di anticorpi alle proteine del latte vaccino nel siero.
All’età di 12, 18, 24 mesi e 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 anni verranno effettuate misurazioni della glicemia post-prandiale e della HbA1c. All’età di 6 e 10 anni verrà inoltre effettuato un OGTT.
La sperimentazione sarà condotta in ottemperanza al protocollo ed alle linee Guida per la Buona Pratica Clinica ed alle Disposizioni normative applicabili.
   
Intervento nutrizionale
Formula studio
Le 2 formule dello studio sono formule complete da un punto di vista nutrizionale per l’alimentazione del neonato. Entrambe sono disponibili in commercio anche in Italia. Esse sono:
  1. Nutramigen in polvere prodotta dalla Mead Johnson Nutritionals. Contiene come fonte proteica caseina idrolizzata, come fonte lipidica oli vegetali, come fonte glucidica polimeri di glucosio.
  2. Formula di controllo Enfamil in polvere, prodotta anch’essa dalla Mead Johnson Nutritionals. E’una formula a base di latte vaccino ed è addizionata di ¼ di Nutramigen allo scopo di rendere le due formule indistinguibili da un punto di vista organolettico.
La formula verrà etichettata in 4 differenti colori – 2 per la formula di studio e 2 per la formula di controllo. Ciascun neonato riceverà esclusivamente la formula di quel particolare colore per tutta la durata dello studio. Ciò consente una maggiore aderenza al protocollo in cieco, facilita il controllo della randomizzazione al momento della analisi dei dati ed evita errori nella assegnazione della formula in quanto la famiglia riconosce il “proprio colore”. Solo la Mead Johnson Nutritionals conoscerà la corrispondenza tra tipo di formula e colore dell’etichetta.
Ciascun centro conserverà una certa quantità di formula di ciascun colore in modo da poter dare alla famiglia la formula adatta nel momento in cui ci sia necessità.
Tutte le madri reclutate per lo studio saranno incoraggiate ad allattare al seno i propri neonati. I neonati saranno comunque randomizzati al più presto possibile in modo che il reparto di nonatologia o la madre abbiano a disposizione la formula appropriata qualora la madre non sia in grado di allattare al seno. Lo l’intervento nutrizionale durerà fino al compimento del 6° mese. Se la madre scegliesse di allattare il bambino fino a tale età senza introdurre altri alimenti integrativi, le sarà suggerito di utilizzare la formula studio dopo tale età per almeno 2 mesi, cioè fino agli 8 mesi. Allo stesso modo, se l’esclusivo allattamento al seno dovesse durare fino ai 5 mesi, il bambino riceverà la formula dello studio per almeno 2 mesi cioè fino all’età di 7 mesi. In ogni caso, le restrizioni dietetiche previste termineranno invariabilmente agli 8 mesi. La durata di intervento scelta per lo studio è fattibile da un punto di vista pratico e copre con un notevole margine di sicurezza i 2-3 mesi in cui si ritiene che l’intestino neonatale sia permeabile alle proteine esogene, come suggerito da numerosi studi epidemiologici.
Il trial dovrebbe alterare l’alimentazione del neonato il meno possibile. L’allattamento al seno sarà ad esclusiva discrezione della madre e del pediatra curante.
Informazioni dietetiche
Le informazioni sulla condotta alimentare per il neonato verranno date alla madre durante la gravidanza o in occasione del ricovero in ostetricia per il parto. A 7-10 gg dalla nascita la dietista chiamerà la madre per informarla del risultato della tipizzazione genetica, fornirà ulteriori informazioni dietetiche verificando la dieta del neonato nel periodo precedente e chiarirà eventuali dubbi o problemi insorti. Ulteriori telefonate verranno effettuate ad un mese e a 2, 4 e 5 mesi, mentre a 3, 6 e 9 mesi verranno effettuate delle visite di controllo in occasione delle quali verrà praticato anche il prelievo di sangue per lo studio degli anticorpi anti insula pancreatica e contro le proteine del latte insieme ad un esame clinco.
Le visite successive saranno fatte a 12, 18, 24 mesi e annualmente fino al 6° anno.
I familiari riceveranno informazioni scritte e verbali sulle modalità di allattamento e svezzamento dei neonati. Verrà dato ai genitori un manuale con indicate le modalità di alimentazione del neonato, le età a cui è consigliato introdurre i vari cibi secondo quanto prescritto dalle linee guida alimentari di ciascun paese. E’ importante che non vengano somministrate al neonato proteine del latte vaccino sotto qualsiasi forma. Perciò non si dovranno dare al bambino latte, yogurt, formaggi, formule a base di latte vaccino e di soia, carne di manzo o vitello, alimenti contenenti estratti di carne, proteine del latte e simili di cui sarà fornita una lista dettagliata alla famiglia. Verrà fornita inoltre ai genitori una lista di pappe e alimenti per neonati disponibili sul commercio che si possono utilizzare per lo svezzamento in quanto non contengono gli alimenti proibiti. Il personale dello studio sarà costantemente disponibile per chiarimenti in merito all’alimentazione del bambino. La dieta del bambino sarà comunque normale dopo gli 8 mesi d’età al più tardi, come già detto.
Monitoraggio della compliance alla dieta priva di proteine del latte
La compliance alla dieta priva di proteine del latte verrà valutata al momento della dimissione dal nido. Successivamente verrà valutata con interviste telefoniche a 1-2 settimane, a 1 mese e a 2, 4 e 5 mesi, poi con interviste di persona in occasione delle visite di controllo a 3, 6 ed eventualmente 9 mesi. In tali occasioni verrà registrato anche il quantitativo di formula che il bambino ha assunto mediante registrazione del numero di barattoli aperti nel periodo precedente, misura della formula consumata e stima della formula gettata via o utilizzata per altri scopi. La formula non utilizzata verrà restituita alla fine dello studio. La compliance alla dieta priva di proteine del latte verrà anche valutata mediante dosaggio a 3 e 6 mesi degli anticorpi contro le proteine del latte eventualmente presenti nel siero del bambino, che sono espressione della esposizione alle proteine del latte stesse. Il dosaggio degli anticorpi contro le protteine del latte vaccino verrà effettuato inoltre in occasione di tutte le altre visite annuali fono al 10° anno allo scopo di valutare la relazione tra immunità contro le proteine del latte vaccino ed autoimmunita contro la beta-cellula pancreatica.
La stretta aderenza al protocollo dello studio verrà verificata periodicamente da Montor esperti.
   
Diario clinico del neonato
Al momento della randomizzazione verrà raccolta una anamnesi relativa alle condizioni cliniche durante la gravidanza e al periodo perinatale sia del neonato che della madre (compresi peso alla nascita ed età gestazionale). Si sottolinea che lo studio verrà condotto solo in nati a termine e non nei pretermine (vedi Criteri di Esclusione). Verrà inoltre effettuato un esame obiettivo sul neonato ed il tutto registrato sul Case Report Form.
Follow up durante il periodo di intervento
Il pediatra curante verrà costantemente informato di tutto ciò che il neonato farà e dovrà fare.
Il bambino verrà visitato in ospedale all’età di 3, 6, 9, 12, 18 e 24 mesi, e all’età di 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 anni, o se dovesse sviluppare il diabete. L’esame clinico effettuato a ciascuna visita (per es. peso, altezza) verrà registrato sul Case Report Form. In occasione delle visite verrà raccolto anche un campione di siero per la misurazione degli anticorpi anti insula pancreatica. Tutti i campioni verranno aliquotati e congelati fino al momento dell’analisi che avverrà centralmente presso il laboratorio dell’università di Helsinki in Finlandia.
All’età di 12, 18, 24 mesi e 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 anni verranno effettuate misurazioni della glicemia post-prandiale e della HbA1c. All’età di 6 e 10 anni verrà inoltre effettuato un OGTT.
Verrà posta diagnosi di diabete tipo 1 se è soddisfatto almeno uno dei seguenti criteri:
  1. trattamento insulinico e almeno una delle seguenti
    • storia clinica di chetoacidosi
    • almeno 2 glicemie a digiuno =7.0 mmol/l
    • glicemia casuale =11.1 mmol/l insieme a b. o sintomi
    • due glicemia random =11.1 mmol/l
  2. glicemia a digiuno =7.0 mmol/l e glicemia dopo carico orale di glucosio =11.1 mmol/l (1.75 g/kg di peso fino ad un massimo di 75 g), cioè una curva da carico orale di tipo diabetico secondo i criteri stabiliti da ADA/WHO
 
Dopo il 10 anno di età il follow up potrà eventualmente proseguire mediante il registro del diabete tipo 1 che è operante in Sardegna sotto la responsabilità del dr Marco Songini (Registro Eurodiab Sardegna).
   
Metodiche applicate
Screening genetico
La selezione dei genotipi a rischio si basa su precedenti studi di rischio calcolando un ragionevole tempo di reclutamento. Sarà basata sulla selezione dei seguenti aplotipi:
  • HLA-DQB1*0302/DQA1*05-DQB1*02
  • HLA-DQB1*0302/x (dove x è diverso da DQB1*02, DQB1*0301 o DQB1*0602)
  • HLA- DQA1*05-DQB1*02/y (dove y è diverso da DQA1*0201- DQB1*02, DQB1*0301, DQB1*0602 o DQB1*0603)
  • HLA- DQA1*03-DQB1*02/y (dove y è diverso da DQA1*0201- DQB1*02, DQB1*0301, DQB1*0602 o DQB1*0603)
Un familiare di primo grado di diabetico che presenta uno di questi aplotipi ha un rischio del 17.1% di sviluppare entro 6 anni multipli anticorpi anti insula pancreatica, rispetto al 2.8% di chi non ha tali aplotipi.
Ai genotipi HLA DQB1 utilizzati nel pilot study sono stati aggiunti quelli DQA1. L’effetto di questa ulteriore tipizzazione è minimo per le popolazioni nordeuropee, ma è molto importante per altre popolazione ad es. i sardi.
Popolazione
Diabete tipo 1
Controlli
Ref.
%
numero
%
numero
Estonia 78.4 97 14.1 269 Nejentsev at al. Tissue Antigens 1998; 52:473
Finlandia 81.0 316 22.5 1000 Ilonen et al. Eur J Immunogenet 2000
Ungheria 87.5 112 21.0 210 Hermann et al. unpublished
Italia (Sardegna) 90.0 100 40.0 100 Songini & Ilonen, unpublished
Olanda 77.6 205 26.9 840 Schipper et al. unpublished
Russia 76.3 211 15.9 413 Nejentsev at al. Tissue Antigens 1998; 52:473
USA (Porto Rico) 78.9 114 26.9 108 Santiago, Trucco & Frazer, unpublished
L’analisi genetica verrà effettuata in un laboratorio centralizzato dotato di notevole esperienza in materia (Università di Turku, Finlandia – prof. Iorma Ilonen).
Screening immunologico
Come markers surrogati del diabete tipo 1 e come marcatori del danno immunomediato alla beta cellula pancreatica verranno utilizzati gli anticorpi anti insula pancreatica rappresentati da ICA (anticorpi anti insula), GADA (anticori anti glutammico decarbossilasi), IA-2 (anticorpi contro una proteina della famiglia delle tirosina fosfatasi) e IAA (anticorpi anti insulina). Tutti gli anticorpi verranno misurati in un laboratorio centralizzato (Università di Helsinki diretto dal prof. M. Knip) dotato di grande esperienza nell’analisi degli anticorpi associati al diabete. Tale laboratorio partecipa inoltre a programmi di standardizzazione e valutazione di qualità delle metodiche impiegate. L’analisi dei campioni verrà effettuata in cieco. Le possibili differenze tra i dosaggi in momenti diversi verranno attentamente monitorizzate mediante l’inserimento al momento dell’analisi di 3 standard a concentrazione nota di anticorpi (basso, medio ed alto titolo). Uno scostamento superiore al 10% verrà ritenuto non accettabile e quei dosaggi saranno ripetuti.
Metodiche di analisi:
ICA: immunofluorescenza indiretta su sezioni di pancreas umano congelato di gruppo sanguigno 0. Verranno usati anticorpi contro le IgG umane marcati con fluorescina per individuare gli ICA sul tessuto. La positività in un dosaggio verrà riconfermata con una seconda analisi. Il titolo anticorpale verrà espresso in JDFu.
IAA: verranno dosati secondo la metodica RIA proposto da Williams A e coll. Il dosaggio verrà misurato su curva standard e il livello di positività sarà rappresentata da valori superiori al 99° percentile della popolazione normale. Campioni che supereranno il 95° percentile in una prima analisi verranno testati nuovamente per confermare la positività.
GADA e IA-2: verranno dosati con immunoprecipitazione in RIA. La positività sarà rappresentata dal 99° percentile della popolazione normale. Valori tra 97,5° e 99,5° percentile verranno rianalizzati per verificare l’esatto livello anticorpale.
Anticorpi anti proteine del latte
Verranno dosati Ab anti beta-lattoglobulina (IgG e IgA), Ab anti caseina (IgG e IgA), Ab anti sieroalbumina bovina (IgG e IgA) e Ab anti proteine del latte (IgG, IgA, IgM) con metodica ELISA.
Risposta cellulare
La risposta delle cellule mononucleate del sangue contro gli antigeni dell’insula pancreatica (Insulina, GAD65,p69 e IA-2), contro le proteine del latte (betalattoglobulina, sieroalbumina bovina beta caseina e insulina bovina) e contro mitogeni verranno studiate mediante test di proliferazione e dosaggio della secrezione di citochine (INF e IL4) a livello intracellulare e nel supernatante. Verranno inoltre studiate alcune proteine di adesione cellulare (ICAM-1 e LFA-1) nel sangue periferico.
   
Analisi statistica
Verranno testate due ipotesi
  1. i bambini nel gruppo alimentato con formula a base di idrolizzato di caseina avranno una incidenza ridotta di anticorpi anti insula pancreatica rispetto al gruppo di controllo
  2. i bambini nel gruppo alimentato con formula a base di idrolizzato di caseina avranno una ridotta incidenza di diabete tipo 1
La prima ipotesi verrà studiata analizzando i dati longitudinali ottenuti con misure ripetute secondo tempi standard di numerose variabili, che costituiscono potenziali fattori di confondimento (cioè fattori il cui effetto non è stato eliminato dalla randomizzazione), fattori di modificazione (ad es differenze di peso ed altezza che possono modificare l’effetto della esposizione alle proteine del latte) e variabili di esito dello studio (per es. gli anticorpi anti insula). Ad ogni tempo standard ogni singolo autoanticorpo sarà diviso in positivo o negativo e riassunte. L’esposizione alle proteine del latte o no sarà inclusa nel modello, così come l’età di inizio della formula, la durata dell’allattamento al seno, e la dose totale di formula assunta in quanto sono possibili fattori di confondimento. Saranno inoltre testate possibili interazioni ed effetti delle varibili considerate.
Verranno utilizzati due modelli statistici per testare l’ipotesi che l’alimentazione neonatale con idrolizzato di caseina protegga dall’insorgenza di autoanticorpi anti insula pancreatica: 1) verrà applicato un modello lineare generalizzato e un modello che tenga conto di effetti random. Questi modelli vengono impiegati nell’analisi di misure ripetute e possono ovviare alla mancanza di alcune rilevazioni o errori nei tempi di rilevazione; 2) per la descrizione dei dati, la associazione di una varibile all’insorgenza di anticorpi in un dato momento temporale verrà valutata applicando un modello di regressione logistica analogo a quello usato nel DCCT Study.
L’analisi della seconda ipotesi verrà effettuata considerando l’età di insorgenza di diabete come l’unico outcome in modo analogo ad uno studio di coorte inserendo nel modello in cui l’esposizione alle proteine del latte sia il fattore di rischio principale e le altre variabili come fattori secondari; verrà analizzata anche in questo caso la variabile tempo. Verrà inoltre misurato il rischio relativo di sviluppare il diabete nei due gruppi in relazione al tempo (curva di sopravvivenza), come pure l’incidenza della malattia nei due gruppi aggiustati per le possibili variabili di confondimento.
L’applicazione dei metodi statistici avverrà sotto la supervisione del Dr Paul Knekt, Dept. Of Health and Disability, National Public Health Institute, Helsinki, Finland.
   
Data Base
L’inserimento dei dati in modo del tutto anonimo, la loro consultazione, la randomizzazione dei soggetti, la raccolta e il controllo di qualità delle informazioni raccolte verrà effettuato mediante l’utilizzo di uno specifico database disponibile su internet. Esso è dotato di elevata sicurezza ed è costituito sul modello di quelli già utilizzati in altri studi di prevenzione del diabete tipo 1 (Diabetes Prevetion Trial 1 – DPT-1).
La sicurezza del database sarà garantita mediante la crittografia dei dati e la autenticazione degli utilizzatori. I dati inseriti tramite il sito web verranno processati utilizzando la tecnologia Secure Socket Layer, che consente una crittografia dei dati a 128-bit, conservando l’integrità del messaggio. Al momento dell’utilizzo dei dati, l’utente dovrà essere identificato prima di ottenere qualsiasi accesso ai dati. L’utente dovrà inserire un codice utente (user ID) unico ed individuale, e una password che sarà confrontata e verificata nell’elenco degli utenti. Una volta verificata, verrà creata una sezione personalizzata in base ai diritti di accesso dell’utente in questione. Un utente può non aver diritto ad accesso, avere accesso per scrivere e leggere i dati, può avere accesso esclusivamente per l’inserimento di alcuni dati. Tali tipologie di accesso sono predeterminate per ciascun utente e sono stabilite a priori dal responsabile di ciascun centro partecipante al TRIGR.
   
Analisi durante lo studio
L’insorgenza di autoanticorpi contro l’insula pancreatica e di diabete clinicamente manifesto verrà monitorata da un comitato esterno di monitoraggio allo scopo di valutare il più precocemente possibile qualsiasi effetto negativo del trattamento o individuare un inaspettato effetto protettivo. Il comitato di coordinamento esterno sarà costituito da scenziati di fama ed esperienza mondiali nel settore, che non siano membri del gruppo di studio. Esso comprenderà esperti di: biostatistica, immunologia, pediatria, diabetologia. Anche se il follow up continuerà, i codici verranno aperti e i risultati pubblicati se si dovesse raggiungere una significatività statistica dei risultati delle analisi intermedie, stabilita dal comitato esterno di monitoraggio.
   
Training
Perché il protocollo dello studio sia applicato in modo uniforme in tutti i centri partecipanti, è essenziale effettuare un accurato procedimento di educazione del personale coinvolto. Un incontro di training verrà organizzato all’inizio del primo anno per le varie aree (Europa, USA e Canada). Un Monitor con esperienza acquisita durante il pilot study in Finlandia si occuperà di verificare a livello locale la corretta applicazione del protocollo e fornirà ulteriori occasioni di insegnamento per il personale.
Nella educazione del personale verrà data particolare enfasi agli aspetti psicologici di approccio alla madre, in modo da evitare quanto più possibile di generare ansia nelle famiglie.
   
Personale e mezzi coinvolti/finanziamento
Lo studio sarà finanziato da fondi che in diversa misura sono stati stanziati da:
  • National Institute of Health americano (NIH)
  • Unione Europea
  • European Foundation for the Study of Diabetes (EFSD) dell’European Association for the Study of Diabetes (EASD)
Nessun onere aggiuntivo sarà dovuto dalla Azienda Ospedaliera Brotzu per lo svolgimento dello studio. Tutti i materiali necessari verranno acquistati con i fondi del progetto.
   
Aspetti etici e tutela della privacy
Le minoranze etniche non verranno escluse dallo studio. Inoltre è stato operato uno sforzo notevole in modo da includere numerosi centri di tutto il mondo ed inserire quindi tutte le razze e le differenti classi sociali. Nessuna discriminazione verrà fatta in base al sesso.
Le finalità e le modalità dello studio verranno esposte verbalmente e per iscritto ad entrambi i genitori; sarà auspicabile inoltre la approvazione da parte del pediatra curante del neonato. I genitori verranno resi edotti del fatto che i rischi legati alla partecipazione allo studio sono minimi e che nulla cambierà nella assistenza prestata al neonato qualora essi decidessero di non prendere parte allo studio. Tali rischi sono già stati testati nel pilot study condotto in Finlandia e dal fatto che i prodotti utilizzati nell’intervento sono disponibili sul mercato anche in Italia da molti anni e si sono dimostrati sicuri e privi di effetti collaterali importanti.
Verrà posta la massima cura affinché lo studio non interferisca con il normale allattamento e con la cura della salute del bambino.
I dati sensibili e il materiale biologico verranno raccolti esclusivamente previa firma di un consenso informato da parte dei genitori del neonato. Essi verranno utilizzati esclusivamente per gli scopi dello studio in oggetto. Qualora ne facesse richiesta, sarà possibile ottenere la distruzione dei dati e dei campioni biologici relativi al soggetto che abbandona lo studio.
Lo studio verrà condotto secondo le norme proposte dalla dichiarazione di Helsinki.
La raccolta dei dati personali e la loro l’archiviazione avverrà nel rispetto delle vigenti Leggi sulla tutela della privacy (Legge 675/96). I dati sensibili relativi ai bambini reclutati in Sardegna saranno archiviati e custoditi presso la Unità Operativa di Diabetologia dell’Azienda Ospedaliera Brotzu sotto la responsabilità del primario Dr Marco Songini. Tutte le informazioni dei soggetti inseriti nello studio saranno inviate in modo completamente anonimo al centro di coordinamento in Finlandia per la elaborazione. I campioni ematici degli stessi soggetti, resi anonimi, verranno custoditi presso la Unità Operativa di Diabetologia dell’Azienda Ospedaliera Brotzu sotto la responsabilità del primario Dr Marco Songini e presso i laboratori di competenza Università di Turku, Finlandia – prof. Iorma Ilonen e Università di Helsinki - prof. M. Knip rispettivamente per le analisi genetiche e immunologiche. I risultati di queste analisi verranno raccolti presso il centro di coordinamento centrale e il centro locale. Tutti i dati e i campioni raccolti verranno utilizzati esclusivamente per gli scopi previsti dallo studio.
   
Ulteriori informazioni relative allo studio possono essere attinte dal sito web ufficiale dello studio: www.trigr.org