SARDIS
Sardinian Diabetes Inheritance Study
 
Protocollo del “SARDIS”
Studio sulla familiarità del diabete tipo 1 in Sardegna
 
BASI SCIENTIFICHE
Il diabete mellito tipo 1 o insulino dipendente (T1DM) è una malattia complessa causata da un insieme di fattori genetici e ambientali. La malattia è causata dalla distruzione delle cellule beta del pancreas producenti l’ormone insulina da parte di una particolare tipo di cellule dello stesso organismo, chiamate linfociti T. Dette cellule, che sono normalmente preposte alla difesa del nostro organismo da parte di infezioni batteriche, nei diabetici non riconoscono più le cellule beta pancreatiche come parte del proprio organismo e le attaccano distruggendole. Il corredo genetico dell'individuo rende più o meno probabile il rischio di contrarre la malattia. Esistono più regioni geniche coinvolte. Il contributo maggiore è determinato da geni contenuti nel sistema maggiore di istocompatibilita (HLA) che spiegano circa il 50% della componente genetica della malattia. Il resto è determinato da almeno altri 10 geni di predisposizione, cosiddetti minori, contenuti in altre regioni cromosomiche. Individualmente i vari geni predisponenti (maggiori e minori) sono normali varianti con importanti funzioni nella regolazione delle risposte immunitarie e metaboliche. La malattia insorge quando vengono contemporaneamente ereditate da uno stesso individuo molteplici varianti di predisposizione. Quindi nessun gene considerato individualmente causerebbe la malattia ma solo la predisposizione ad essa.
L'incidenza della malattia varia grandemente nei diversi gruppi etnici. La più alta incidenza e' stata riportata in Finlandia e in Sardegna (37/100.000 individui nella fascia d'età compresa fra 0-14 anni, tra il 1989 e il 1998, Songini dati non pubblicati), la più bassa in Giappone (1,8 /100.000 nella stessa fascia d'età).
La prevalenza globale del T1DM nelle popolazioni caucasiche ad alto rischio (come quella sarda) è pari allo 0,4% della popolazione giovanile, mentre il rischio di ricorrenza della malattia è del 6-7% nei fratelli e 14-25% nei fratelli HLA identici. Per gemelli MZ (geneticamente identici) di pazienti con T1DM, un recente studio di popolazione, eseguito su un larghissimo numero di individui, ha indicato un rischio cumulativo dalla nascita a 35 anni pari al 70%, una percentuale molto più alta rispetto a quanto precedentemente rilevato (36%) Nel loro insieme queste osservazioni epidemiologiche suggeriscono che per sviluppare il T1DM sono necessari sia fattori genetici che fattori ambientali e che un importante contributo e' apportato da geni localizzati nella regione HLA.
La quantificazione del rischio nei gemelli monozigoti (MZ) è particolarmente importante, in quanto fornisce una stima diretta della penetranza (effetto del genotipo sul fenotipo) per l'intero corredo genetico di suscettibilità. La penetranza del T1DM è chiaramente incompleta perché il rischio empirico per gemelli MZ di pazienti T1DM é inferiore al 100%. Un recente lavoro indica che due terzi dei gemelli MZ discordanti per il T1DM da almeno 7 anni, sono invece concordanti per la presenza di autoanticorpi anti beta-cellule pancreatiche.
Nel loro insieme queste osservazioni enfatizzano l'importanza della componente genetica nella patogenesi del diabete di tipo 1 sia perché la concordanza per la malattia in gemelli MZ è più alta di quanto precedentemente ritenuto, sia perché gemelli discordanti per diabete manifesto sono invece spesso concordanti per autoimmunità. Il contributo relativo della componente genetica e di quella ambientale è stato anche studiato analizzando l'incidenza della malattia in individui emigrati da regioni ad alta incidenza verso regioni ad bassa incidenza. Questo studio eseguito su figli di genitori Sardi residenti nel Lazio (regione a più bassa incidenza rispetto alla Sardegna) ha dimostrato che l’alta incidenza della malattia è dovuta pressoché interamente a fattori genetici (Muntoni et al. Lancet 1997). Analoghi risultati sono stati rilevati nella provincia di Pavia (Tenconi et al. 1998)
Il diabete di tipo 1 non solo è frequente in Sardegna, ma la sua incidenza ha anche mostrato un incremento costante negli ultimi 40 anni. Questo "trend" è presente in altri paesi occidentali e viene comunemente attribuito alla presenza di fattori ambientali predisponenti ancora sconosciuti. Esistono spiegazioni alternative. Per esempio è possibile che in realtà l'incremento di incidenza sia un fenomeno spurio legato ad un'anticipazione della sua età di insorgenza e al fatto che la maggior parte degli studi epidemiologici sono stati eseguiti su individui compresi fra 0 e 14 anni. In altri termini è possibile che non sia il numero totale di malati in aumento ma solo quello dei malati ad esordio precoce. Evidenze preliminari suggeriscono che il fenomeno dell'anticipazione genetica potrebbe svolgere un ruolo nel diabete di tipo 1.
Al momento quindi non esiste nessuna ipotesi soddisfacente, né genetica, né ambientale, per spiegare un così rapido incremento della prevalenza del diabete tipo 1 in Sardegna. Una analisi delle notizie anamnestiche relative ai diabetici afferenti all’Unità di Studio e Prevenzione del Diabete tipo 1 – Dipartimento di Medicina Interna dell’Azienda Ospedaliera Brotzu (Cagliari) ha mostrato una prevalenza inaspettatamente elevata di diabete sia tipo 1 che tipo 2 nei familiari di pazienti affetti da T1DM (tabella).
 
FAMILIARITÀ PER DIABETE IN UN CAMPIONE DI 388 DIABETICI SARDI DI TIPO 1
 
Familiari diabetici
Diabete insulino-trattato
Diabete non insulino-trattato
Nonni
26%
4%
15%
22%
85%
Padre
12%
5%
40%
7%
60%
Madre
8%
1%
19%
7%
81%
Fratelli
13%
11%
88%
2%
125
Figli
1%
1%
100%
0
0
Zio/zia
34%
15%
45%
19%
55%
Cugini/nipoti
25%
24%
95%
1%
5%
Almeno un familiare di 1° o 2° grado
66%
0
0
0
0
Dati desunti dalla anamnesi familiare condotta sui diabetici di tipo 1 regolarmente seguiti presso l’Unità di Diabetologia dell’Adolescente, Dipartimento Internistico – Azienda Ospedalera Brotzu – Cagliari. Aggiornati al 1/3/2000.
 
L’alta prevalenza di diabetici non insulino-trattati è sorprendente poiché in letteratura è stato descritto solo un lieve eccesso di familiari affetti da diabete tipo 2 nelle famiglie dei diabetici tipo 1 in altre popolazioni europee. Il Bart’s Oxford Study ha mostrato che molti dei familiari diabetici non insulino-trattati hanno marcatori genetici e immunologici compatibili con un diabete autoimmune (tipo1) e ciò porta a pensare che anche in Sardegna l’associazione tra le due forme di diabete non sia reale ma dovuta ad una errata diagnosi. (Bingley, dati non pubblicati). La maggior parte dei familiari di diabetici di tipo 1 precedentemente definiti come di tipo 2 sembrerebbero infatti essere forme di tipo 1 ad esordio più tardivo (LADA).
Se questo verrà a confermato, l’andamento apparentemente epidemico del diabete tipo 1 in Sardegna potrebbe in realtà essere la manifestazione di un cambiamento nell’espressione (anticipazione) di una condizione geneticamente determinata; il che non esclude un ruolo da parte di fattori ambientali che agirebbero su questo terreno genetico favorevole condizionandone ad esempio l’età di insorgenza.
 
OBIETTIVI DELLO STUDIO
Col presente studio si propone un'analisi dettagliata di famiglie estese e multigenerazionali di pazienti diabetici. Uno studio di tale tipo non è finora mai stato condotto in Sardegna.
Tutti i familiari e in particolare quelli precedentemente classificati come di tipo 2 saranno studiati approfonditamente da un punto di vista genetico, immunologico e metabolico in modo da definire più correttamente la trasmissione ereditaria del diabete di tipo 1 all'interno delle famiglie. Si potranno inoltre approfondire i legami genetici tra diabete e altre malattie autoimmuni.
In particolare lo studio si propone di effettuare:

  • caratterizzazione fenotipica dei probandi diabetici: eta' di insorgenza, necessita' di insulina, storia di chetoacidosi, livelli di C-peptide basale, altre patologie autoimmuni concomitanti;
  • raccolta della storia familiare di primo e secondo grado per diabete, malattia celiaca, tireopatie autoimmuni, morbo di Addison, anemia perniciosa, artrite reumatoide, sclerosi multipla e altre malattie autoimmuni, e costruzione di un pedigree per autoimmunita' sulla base dei dati anamnestici familiari;
  • raccolta del materiale genetico dei probandi, dei familiari di primo grado e del maggior numero possibile di quelli di secondo grado per l’analisi dell’HLA e di altri loci genici di interesse;
  • raccolta dei sieri dei probandi, dei familiari di primo grado e del maggior numero possibile di quelli di secondo grado per l’analisi dei marcatori autoanticorpali del diabete tipo 1 e di altre patologie autoimmuni;
  • riclassificazione dei probandi e dei familiari diabetici alla luce delle acquisizioni di tipo clinico-anamnestico, laboratoristico, genetico ed immunologico; costruzione di pedigree estesi per autoimmunita' alla luce di tali acquisizioni;
  • identificazione di soggetti (probandi e loro familiari) affetti da autoimmunita' in forma subclinica, da indirizzare ad un successivo trattamento opportuno.
 
 SUBSTUDIES
 I campioni di siero e il materiale genetico verrà freezato e conservato per possibili future indagini attinenti agli scopi dello studio (es. dosaggio di altri autoanticorpi o tipizzazione di altri loci genici di interesse). Qualsiasi ulteriore analisi dovrà essere vagliata e approvata dai responsabili dei vari gruppi di studio partecipanti e dal comitato etico della struttura di appartenenza.
 
PARTECIPANTI ALLO STUDIO
Dott. Marco Songini e collaboratori – Dipartimento di Medicina Interna – Azienda Ospedaliera “G. Brotzu” – Cagliari (Italy) tel. +39 070 531947-539314, fax +39 070 531947; email: songinim@tin.it

Dott. Francesco Cucca e collaboratori – Università degli Studi di Cagliari – Dipartimento di Scienze Biomediche e Biotecnologie – Ospedale Microcitemico - Via Jenner – 09121 Cagliari (Italy) tel. +39 070 6095549, fax +39 070 503696; email: fcucca@mcweb.unica.it

Prof. Edwin A. M. Gale, prof.ssa Polly Bingley e collaboratori – Department of Diabetes and Metabolism - University of Bristol - Southmead Hospital - Westbury on Trym - Bristol BS10 5NB (United Kingdom) tel. +44 117 9595337, fax +44 117 9595336, email: Edwin.Gale@bristol.ac.uk
 
PROTOCOLLO OPERATIVO
Lo studio interesserà i pazienti diabetici afferenti all’Unità di Studio e Prevenzione del Diabete tipo 1 – Dipartimento di Medicina Interna – Azienda Ospedaliera “G. Brotzu” – Cagliari, e le loro famiglie. I pazienti che regolarmente si sottopongono a visita di controllo ogni 3-6 mesi presso la struttura verranno inseriti nello studio.
Personale e mezzi:
L’onere economico dello studio è condizionato all’ottenimento di finanziamenti da parte della fondazione Telethon. Nessun onere economico aggiuntivo sarà dovuto in ogni caso da parte della Azienda Ospedaliera Brotzu.
Lo studio verrà condotto con la collaborazione di un medico e di personale infermieristico, esterno al personale proprio della Azienda Ospedaliera, dietro opportuno compenso. Tutti i materiali necessari verranno acquistati con i fondi del progetto.
La raccolta dei dati e l’archiviazione degli stessi avverrà nei locali della Unità di diabetologia dell’adolescente dell’Azienda Ospedaliera Brotzu, nel più completo rispetto della vigente legislazione per la tutela della privacy.
I dosaggi autoanticorpali verranno eseguiti nel laboratorio del Prof. Edwin A. M. Gale e prof.ssa Polly Bingley - Department of Diabetes and Metabolism - University of Bristol; la tipizzazione genetica avverrà nei laboratori del Dott. Francesco Cucca – Università degli Studi di Cagliari – Dipartimento di Scienze Biomediche e Biotecnologie – Cagliari (Italy).
Criteri di inclusione:
  • famiglie con almeno un probando seguito presso la struttura diabetologica menzionata;
  • paziente seguito con regolarità dalla medesima struttura (ogni 3-6 mesi);
  • residente in Sardegna;
  • ffetto da diabete mellito tipo 1 diagnosticato in base a criteri clinici e di laboratorio.
 
Prima fase - Esame dei probandi e dei familiari di primo grado
Contattare le famiglie: La raccolta dei campioni di sangue e della anamnesi familiare verrà effettuata, nei limiti del possibile, in associazione alle procedure cliniche cui routinariamente si sottopongono i pazienti diabetici (prelievi e visita), creando il minor disagio possibile. La famiglia verrà contattata telefonicamente o direttamente in occasione di visite ambulatoriali durante le quali verranno date le informazioni necessarie sulle finalità e modalità del progetto di studio.
Raccolta della anamnesi familiare: (sesso, età, data di nascita, presenza di diabete e/o altre patologie, data della diagnosi e sintomi all'esordio, terapia praticata etc. origine geografica dei nonni). Includerà familiari di primo e secondo grado. Avverrà su moduli standard e poi riportata su supporto informatico. Nel contempo verrà data informazione dettagliata ai pazienti e ai familiari in merito allo studio e verrà chiesto loro di firmare un consenso al prelievo e al trattamento dei dati personali (secondo le vigenti norme di Legge).
Raccolta dei campioni di sangue e siero: il campionamento avverrà in due aliquote di sangue intero (in EDTA) e due di siero. Un campione di siero verrà inviato al laboratorio del Dipartimento di Diabetologia e Metabolismo – Università di Bristol (Bristol, GB) per il dosaggio dei marcatori anticorpali; un campione di sangue intero verrà inviato al laboratorio del Dipartimento di Scienze Biomediche e Biotecnologie (Cagliari) per la tipizzazione genetica. Le restanti due aliquote verranno conservate presso l’Unità di Studio e Prevenzione del Diabete Tipo 1 – Azienda Ospedaliera Brotzu – Cagliari. Tutto ciò verrà effettuato in modo anonimo e nel rispetto delle vigenti norme di Legge. Andranno prelevati il paziente, tutti i suoi fratelli eventualmente malati, almeno 1 fratello sano e entrambi i genitori. Si darà la precedenza alle famiglie con più di un fratello affetto.
Seconda fase - Raccolta di campioni di siero e sangue intero dai nonni (ove possibile) in particolare di quelli affetti da diabete mellito.
Terza fase
Individuazione di un ristretto numero di famiglie di particolare interesse e costruzione di pedigree estesi caratterizzati in base agli aspetti clinici, immunologici e genetici: prelievo di campioni di siero e sangue intero dal maggior numero possibile dei familiari di secondo grado.
Quarta fase
  • Dosaggio sui campioni di siero dei marcatori autoanticorpali per diabete (GADA, anticorpi anti glutammicodecarbossilasi; IA2, Anticorpi anti tirosin-fosfatasi; sui positivi verranno dosati anche IAA, anticorpi anti insulina, e ICA, anticorpi anti insula pancreatica) per celiachia (TGA, anticorpi anti transglutaminasi) e per altre autoimmunità ove indicato. I dosaggi di GADA, IA2, IAA e TGA verranno effettuati con metodica RIA gia' descritta precedentemente (v. bibliografia). I dosaggi di ICA verranno misurati in immunofluorescenza indiretta su siero non diluito, come precedentemente descritto (v. bibliografia).
  • Estrazione del DNA e tipizzazione genica per i vari loci di interesse per il diabete tipo 1.
ANALISI STATISTICA DEI DATI
I dati verranno raccolti e archiviati su supporto cartaceo e informatizzato.
Verranno applicate procedure statistiche ad hoc per testare l'ipotesi dell'anticipazione genica.
 
ASPETTI ETICI
La partecipazione al progetto sarà assolutamente volontaria e per tale motivo, al momento dell’arruolamento nello studio, verrà richiesta ai partecipanti la firma di un consenso scritto al prelievo di sangue e al trattamento dei dati personali. Nel caso di raccolta di dati e prelievo di minorenni il consenso verrà firmato da chi esercita la potestà sul minore.
La partecipazione non implicherà modifiche nella qualità dell’assistenza sanitaria prestata ai pazienti dalla struttura diabetologica, né interferirà con essa. Si cercherà inoltre di arrecare il minor disagio possibile, facendo coincidere i prelievi per lo studio con le visite che routinariamente i pazienti eseguono presso la struttura diabetologica.
Il trattamento dei campioni avverrà in modo anonimo previa attribuzione di un codice alfanumenrico di identificazione per ciascun individuo. Precauzioni verranno prese per la archiviazione a la custodia di tutti i dati raccolti affinché venga tutelata la privacy dei singoli partecipanti, secondo le vigenti norme di Legge.
L’accesso ai dati sarà consentito esclusivamente ai responsabili delle strutture partecipanti allo studio e alle persone di loro fiducia da essi delegate, esclusivamente per le finalità dello studio stesso.