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A PROTEOMICS APPROACH FOR STUDYING HUMORAL AUTOIMMUNITY
IN LATENT AUTOIMMUNE DIABETES OF ADULTHOOD (LADA)
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Il
diabete mellito rappresenta un gruppo eterogeneo
di
malattie metaboliche
caratterizzate da iperglicemia derivante da
un difetto della secrezione insulinca, dell’azione
dell’insulina o di entrambe. L’autoimmunità contro
le b-cellule, che è caratteristica del
diabete tipo 1A è presente nel 10-15%
dei soggetti clinicamente diagnosticati come
affetti da diabete tipo 2. Nell’UK Prospective
Diabetes Study (UKPDS) si è notato che
tra i pazienti con diabete tipo 2, la presenza
di autoanticorpi contro la decarbossilasi dell’acido
glutammico (GADA) e di anticorpi contro il citoplasma
delle cellule delle insulae pancreatiche (ICA) è predittiva
dello sviluppo di insulino-dipendenza rispetto
a coloro i quali non presentano la positività per
tali autoanticorpi. Se la risposta autimmune
contro le cellule insulari è realmente
presente nel 10-15% dei soggetti clinicamente
diagnosticati come affetti da diabete tipo
2, fino a 2 milioni di americani potrebbero
avere
una forma di diabete autoimmune non correttamente
diagnosticata, una prevalenza simile a quella
rilevata nei bambini.
La ricerca oggetto del presente studio avrà quindi
lo scopo di identificare nuovi epitopi contro cui
si dirige la risposta autoimmune b-cellulare e
che potrebbero partecipare al meccanismo di attivazione
o perpetuazione di tale risposta autoimmune nei
pazienti affetti da LADA, mediante l’applicazione
di nuove metodiche di proteomics su sieri provenienti
da pazienti sardi caratterizzati come LADA (Latent
Autoimmune Diabetes of the Adult). Essa verrà condotta
in Sardegna presso la Struttura Complessa di Diabetologia
e la Struttura Semplice Dipartimentale di Microbiologia,
Dipartimento Servizi Speciali di Diagnosi e Cura
dell’Azienda Ospedaliera Brotzu di Cagliari
e negli USA presso la Division of Immunogenetics,
Diabetes Institute, University of Pittsburgh
School of Medicine, PA.
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Obiettivi
Lo scopo principale della proposta di studio è quindi
quello di identificare nuovi target molecolari
della autoimmunità nei pazienti sardi affetti
da LADA. Gli anticorpi contro questi determinanti
molecolari potrebbero in futuro essere utilizzati
a scopo diagnostico, oltre a consentire una migliore
comprensione della patogenesi del LADA.
Risultati preliminari ottenuti presso il laboratorio
della Division o Immunogenetics di Pittsburgh da
studi condotti con la medesima tecnologia di proteomics,
hanno identificato due proteine candidate ad essere
marcatori della risposta autoimmune contro le insulae
pancreatiche. Il cDNA umano corrispondente alle
due proteine identificate, verrà successivamente
clonato e ne verrà valutata la rilevanza
per lo sviluppo del diabete autoimmune mediante
tecniche di immunoprecipitazione, utilizzando proteine
sintetizzate in vitro come sorgente dell’antigene.
Le proteine candidate verranno poi sottoposte ad
ulteriori analisi strutturali. L’obiettivo
finale sarà quindi quello di aumentare la
specificità e il valore predittivo delle
metodiche di misurazione degli autoanticorpi nella
fase preclinica del diabete allo scopo di migliorare
la sensibilità e specificità nel
rilevare la malattia nei pazienti affetti da LADA.
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Razionale
dello studio
La Sardegna rappresenta un modello per studiare
il diabete Tipo 1 e le altre malattie autoimmuni.
Essa presenta un isolamento geografico e una popolazione
relativamente piccola (di 1,6 milioni di abitanti)
che la rendono ottimale per la conduzione di questi
studi. La popolazione sarda è inoltre geneticamente
omogenea e presenta numerose peculiarità genetiche,
culturali e linguistiche dovute al lungo isolamento,
al piccolo numero di fondatori e alla pressione
di fattori di selezione come ad es la malaria.
Per questo motivo in Sardegna sono particolarmente
frequenti alcune malattie geneticamente determinate
caratterizzate da mutazioni peculiari nell’isola
(talassemia, malattia di Wilson, APECED) come anche
numerose malattie autoimmuni (diabete tipo 1, celiachia,
sclerosi multipla). Nonostante la elevata incidenza
del diabete tipo 1 nei bambini, la seconda più alta
al mondo, dati preliminari riguardanti la prevalenza
di LADA nel nord dell’isola, definito come
diabete di tipo 2 con positività per i GADA,
ha mostrato essere simile a quanto descritto in
altri paesi.
Per quanto riguarda in particolare il diabete autoimmune,
gli anticorpi circolanti sono stati studiati in
modo estensivo nei bambini come markers diagnostici
della fase preclinica della malattia. La specificità per
la malattia e il valore predittivo di questi marcatori
anticorpali hanno ormai raggiunto un livello di
precisione tale che una combinazione di essi è in
grado di identificare i soggetti ad alto rischio
di sviluppare la malattia tra i parenti di primo
grado di soggetti diabetici di tipo 1. Al contrario,
poco o nulla si sa in merito alla risposta immune
umorale nei LADA, né per quale motivo tali
individui non sviluppino precocemente insulino
dipendenza, e a tutt’oggi la diagnosi di
LADA viene fatta solo sulla base della presenza
di GADA o ICA nel siero dei pazienti diabetici.
La presenza di multipli anticorpi diretti contro
le insulae pancreatiche ha dimostrato essere un
importante indice di predizione del successivo
sviluppo della malattia clinica. Infatti, in base
alle conoscenze attuali, nei pazienti con LADA,
gli ICA e i GADA sembrerebbero essere i principali
markers associati con l’insulino-dipendenza,
mentre numerosi ricercatori hanno rilevato frequenze
di IA2 così basse da non rendere tale marcatore
utile in questa categoria di pazienti. Non è tuttavia
chiaro se siano presenti nel LADA altri marcatori
autoanticorpali. E’ da notare che alcuni
studi pubblicati e dati non pubblicati ottenuti
dall’UKPDS hanno mostrato che un certo numero
di pazienti con LADA sono positivi per ICA ma non
per GADA o IA2. Risultati preliminari a supporto
di ciò sono stati ottenuti anche presso
la Division of Immunogenetics di Pittsburgh su
pazienti con diabete tipo 1 di età superiore
ai 17 anni. Si è infatti rilevata positività per
ICA nel 52% (34/65) dei pazienti affetti da diabete
tipo 1 che erano negativi per IA2 e GADA, segno
quindi che altri antigeni diversi dalla GAD e dall’IA2
contribuiscono alla positività all’immunofluorescenza
degli ICA.
In base a quanto precedentemente esposto, appare
quindi necessaria l’individuazione di nuovi
marcatori immunologici diretti contro specifici
autoantigeni nei LADA.
Ogni nuovo marcatore potrebbe infatti fornire nuovi
elementi per la comprensione della eziologia della
malattia e della sua progressione. L’identificazione
di nuovi autoantigeni consentirà poi la
nascita di studi sulla patogenesi della malattia
e sulla tolleranza immunologica, che potranno quindi
essere utili per un futuro sviluppo di terapie
preventive, poiché esistono numerose evidenze
a supporto del fatto che un precoce intervento
nella fase preclinica potrebbe consentire una prevenzione
della malattia diabetica o almeno un ritardo nella
sua insorgenza.
La scoperta di nuovi marcatori anticorpali nel
LADA, quindi, aumenterà la capacità predittiva
dei marcatori attualmente disponibili soprattutto
nella popolazione generale, dove le nostre capacità di
individuare i soggetti a rischio di sviluppare
il diabete tipo 1 sono molto più ridotte
di quanto non siano per i familiari di primo grado
dei soggetti diabetici. Inoltre questi nuovi marcatori
potrebbero rappresentare degli indici di velocità di
progressione della malattia verso la fase clinica,
soprattutto nel caso in cui siano specifici per
il LADA, caratterizzato da un esordio tardivo e
da un più lento declino della funzione b-cellulare
rispetto al diabete tipo 1 “classico”.
Essi potrebbero inoltre essere utili per valutare
l’eventuale successo di un trapianto di insulae.
La disponibilità delle sequenze proteiche
dei nuovi antigeni e la possibilità di sintetizzarle
in vitro stimolerà inoltre la nascita di
studi per la comprensione della patogenesi della
malattia e della tolleranza in animali da esperimento,
o nello studio della risposta T-cellulare.
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Risultati
preliminari
Alcuni risultati preliminari sono stati prodotti
recentemente presso il Department of Immunogenetics
dell’University of Pittsburgh sui sieri di
16 diabetici di tipo 1 e 18 controlli non diabetici.
Tecniche di Western Blotting e di impregnazione
argentica hanno mostrato l’elettiva reattività dei
sieri dei diabetici con alcune particolari frazioni
proteiche delle insulae pancreatiche. Il confronto
con le librerie dell’NCBI e del Expasy Protome
Website consentirà di individuare in quale
punto della mappa proteomica vengono visualizzate
le nuove proteine reattive individuate e di differenziarle
da quelle contro cui reagiscono gli autoantigeni
delle b-cellule già noti, favorendone la
caratterizzazione.
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Scopi
specifici |
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1) |
identificare
le proteine autoreattive nelle b-cellule nei
pazienti con LADA mediante l’applicazione
delle tecniche di proteomics. |
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2) |
Identificare
la sequenza cDNA delle proteine candidate allo
scopo di ottenere un cDNA completo
utilizzando 5’RACE o una library di espressione
del cDNA delle cellule insulari |
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3) |
Clonare
le molecole o i domini all’interno
di vettori di trascrizione/traduzione in vitro
e costruire un radioimmunoassay simile a quelli
attualmente in uso per il dosaggio di GADA
e IA2 |
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Gli
scopi elencati precedentemente verranno sviluppati
utilizzando i sieri ottenuti da una coorte
di pazienti LADA sardi. |
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Gruppi
collaboranti allo studio
Organizzazione ed amministrazione
Il presente studio sarà condotto in collaborazione
tra le seguenti strutture e personale con le funzioni
di seguito indicate:
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· Struttura
Complessa di Diabetologia – Azienda
Ospedaliera Brotzu di Cagliari – Italia |
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o |
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o |
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o |
oPersonale
medico e infermieristico che potrà secondo le necessità collaborare
alla raccolta dei campioni dei pazienti LADA |
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Tale
struttura svolgerà principalmente il
compito di raccolta dei campioni di siero dei
pazienti e dei controlli e di caratterizzare
da un punto di vista clinico i pazienti, l’archiviazione
dei dati personali e clinici dei pazienti e
l’archiviazione dei sieri, a cui si affiancherà la
discussione scientifica sui risultati ottenuti |
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· Struttura
Semplice Dipartimentale di Microbiologia, Dipartimento
Servizi Speciali di Diagnosi e Cura dell’Azienda
Ospedaliera Brotzu di Cagliari – Italia |
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o |
o Dr.
Alessandro Palomba – Direttore |
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o |
o Dr.
Marco Liguori |
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Tale
struttura avrà il compito di effettuare
il dosaggio di ICA, GADA e IA2 necessari per
la identificazione dei soggetti LADA e dei
controlli, a cui si affiancherà la discussione
scientifica sui risultati ottenuti. |
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· Struttura
Complessa Centro Trasfusionale - Azienda Ospedaliera
Brotzu di Cagliari – Italia |
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o |
o Dr. Michele Bajorek
- Direttore - e suoi collaboratori |
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Tale
struttura avrà il compito di raccogliere
i campioni dei controlli sani necessari per
la valutazione della specificità e sensibilità dei
test immunologici messi a punto |
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· Department
of Immunogenetics – University of Pittsburgh
School of Medicine – Pittsburgh, PA,
US |
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o |
o Prof. Massimo
Pietropaolo e suoi collaboratori |
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Presso
i cui laboratori verranno eseguiti gli studi
di ricerca e caratterizzazione dei nuovi marcatori
autoanticorpali. I sieri e le informazioni
cliniche dei pazienti verranno quindi trasferiti
a questo centro in modo anonimo. A ciò si
affiancherà la discussione scientifica
sui risultati ottenuti. |
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Popolazione
da studiare
Criteri di inclusione e di esclusione
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· Soggetti
LADA definiti come soggetti diabetici: |
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o |
o Positivi per autoanticorpi anti insula pancreatica
(ICA, GADA e/o IA2) |
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o |
o Diagnosticati
ad un’età uguale
o superiore ai 40 anni |
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o |
o Se
diagnosticati ad un’età inferiore
a 40 anni, non insulinodipendenti per almeno 1
anno dalla diagnosi. La insulino indipendenza verrà giudicata
sulla base del controllo glicometabolico. |
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· Soggetti
di controllo diabetici di tipo 2 negativi
per autoanticorpi antiinsula pancreatica.
La selezione di questo gruppo di soggetti
di controllo consentirà di escludere
che i marcatori eventualmente rilevati siano
da correlare alla alterazione del metabolismo
glucidico piuttosto che al fenomeno autoimmune
in sé. |
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· Soggetti
di controllo sani di pari età. |
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· Soggetti
di controllo affetti da diabete tipo 1 con
esordio “classico” per eventualmente
poter identificare dei marcatori specifici
per il LADA piuttosto che per il diabete autoimmune
in generale. |
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La
numerosità della popolazione da studiare,
in particolare la numerosità dei controlli,
dipenderà dal numero di LADA che sarà possibile
individuare. Sulla base del numero di diabetici
tipo 2 seguiti regolarmente presso la Struttura
Complessa di Diabetologia della AOB e sulla
base dei dati di letteratura sulla prevalenza
di LADA tra i pazienti affetti da diabete tipo
2, si stima di poter reclutare fino ad un massimo
di 500 pazienti con LADA. |
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Metodiche
da applicare: |
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Prelievo
di sangue |
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La
ricerca dei nuovi marcatori immunologici verrà effettuata
su campioni di siero del paziente.
I pazienti verranno inclusi nello studio al momento
in cui il medico diabetologo riterrà opportuno
sottoporli alla ricerca degli anticorpi anti insula
pancreatica nell’ambito della normale attività di
follow up clinico. In tale occasione verrà raccolto
il campione di siero necessario per lo studio dopo
la firma del consenso informato da parte del paziente.
Presso la Struttura Semplice Dipartimentale di
Microbiologia, Dipartimento Servizi Speciali di
Diagnosi e Cura dell’A.O.B. sono stati conservati
i campioni di siero dei soggetti che hanno eseguito
il prelievo per il dosaggio degli anticorpi anti
insula pancreatica (ICA, GADA e IA2). La determinazione
di tali autoanticorpi è stata solo recentemente
inserita nel pannello degli esami praticati presso
la A.O.B. e i campioni di siero sono stati conservati
a maggiore tutela della qualità dei risultati
ottenuti. Dopo l’esecuzione dell’esame
il campione di siero è stato congelato e
conservato alla temperatura di -20°. Tali sieri
potrebbero essere agevolmente utilizzati per il
presente studio, dopo firma da parte del paziente
del modulo di consenso informato, evitando di sottoporre
il paziente stesso ad un nuovo prelievo.
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Raccolta
del consenso informato
Il consenso informato al prelievo (come da modulo
allegato) potrà essere firmato al momento
della prescrizione del dosaggio degli anticorpi
anti insula o al momento del prelievo.
I pazienti di cui è già disponibile
il siero verranno invece ricontattati telefonicamente
e verrà loro proposto di partecipare allo
studio e di firmare il consenso informato (come
da modulo allegato) in occasione della successiva
visita diabetologica o in occasione di un appuntamento
fissato a tale scopo. Si prenderanno tutti gli
accorgimenti per creare al paziente il minor disagio
possibile.
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Conservazione
dei sieri
I campioni di sangue ottenuti verranno sottoposti
a sieratura secondo le normali procedure e aliquotati
per poi essere conservati in freezer a -20° fino
al momento del dosaggio.
Le aliquote di siero verranno identificate con
un numero di sieroteca che sarà l’unico
elemento che consentirà la identificazione
della appartenenza del siero ad un particolare
individuo. Tale numero sarà riportato sul
database di registrazione dei soggetti.
I campioni ematici degli stessi soggetti, verranno
custoditi presso la Struttura Semplice Dipartimentale
di Microbiologia, Dipartimento Servizi Speciali
di Diagnosi e Cura dell’A.O.B. sotto la responsabilità del
direttore Dr Alessandro Palomba e verranno analizzati
presso i laboratori del Department of Immunogenetics
della University of Pittsburgh.
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Raccolta
delle informazioni clinche
Una volta ottenuto il campione di sangue e il consenso
del paziente, si procederà alla registrazione
su apposito database informatico dove saranno registrate
le informazioni cliniche relative al soggetto e
quelle necessarie alla classificazione clinica
del tipo di diabete. Queste informazioni verranno
desunte da quanto riportato sulla cartella clinica
di ciascun paziente seguito presso la S.C. di Diabetologia
della A.O.B., senza quindi arrecare ulteriore disagio
al paziente con la raccolta dei dati anamnestici.
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Comunicazione
al paziente dei risultati dei dosaggi effettuati
Il risultato del dosaggio di ICA, GADA e IA2 verrà comunicato
al paziente dal medico diabetologo che ha richiesto
l’esame secondo le normali procedure previste
dalla assistenza clinica diabetologica applicate
dalla S.C. di Diabetologia. Non sarà invece
possibile comunicare al paziente i risultati della
ricerca dei nuovi marcatori sul suo sangue, poiché nulla
si sa al momento della validità di questi
eventuali nuovi marcatori. Il paziente verrà informato
di ciò.
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Database
Le informazioni personali, anamnestiche, cliniche
e relative al prelievo, verranno registrate
su un database informatizzato creato appositamente.
Tali informazioni saranno inoltre periodicamente
(mensilmente) stampate sotto forma di report
ed archiviate anche in forma cartacea allo
scopo di preservare i dati da qualsiasi possibile
incidente che possa avvenire al database.
Verrà inoltre periodicamente (mensilmente)
eseguita una copia di back up su CD.
Il database sarà custodito presso la S.C.
di Diabetologia della AOB sotto la responsabilità del
dr Marco Songini. Le informazioni in esso contenute
potranno essere scambiate tra le strutture collaboranti
allo studio allo scopo della buona riuscita dello
stesso.
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Ricerca
dei marcatori
Le metodiche di laboratorio da applicare per la
ricerca dei nuovi marcatori sono descritte nella
appendice.
Lo sviluppo finale della metodica di radioimmunoassay
per il dosaggio degli autoanticorpi contro le proteine
individuate sarà analogo a quello attualmente
in vigore per il dosaggio degli altri autoanticorpi
anti insula pancreatica IA2, GADA, IAA per i quali
il laboratorio del Department of Immunogenetics
della University of Pittsburgh School of Medicine
ha una provata esperienza.
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Analisi
statistica
Dopo aver clonato le proteine che reagiscono con
i sieri dei pazienti LADA, verrà prodotta
la Reciver Operating Characteristic (ROC) Curve
per ciascun test di laboratorio mettendo in grafico
in ascissa il tasso di veri positivi (sensibilità)
tra i pazienti LADA analizzati (almeno 250) e in
ordinata il tasso di falsi positivi (1-specificità)
ottenuto nei controlli (almeno 250). L’area
sotto la curva verrà calcolata e la differenza
rispetto al valore 0.5 (che indica la assenza di
discriminazione tra diabetici e controlli) analizzata
mediante il test z. Questo stesso approccio è stato
utilizzato in passato per ottimizzare le metodiche
di dosaggio degli anticorpi anti insula già noti.
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Personale
e mezzi coinvolti Nessun
onere aggiuntivo sarà dovuto dalla Azienda
Ospedaliera Brotzu per lo svolgimento del protocollo
di studio.
I fondi necessari per lo svolgimento dello studio
saranno forniti dalla University of Pittsburgh
School of Medicine. Ulteriori fondi potranno essere
ottenuti da parte delle diverse società scientifiche.
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Assicurazione
Nessuna assicurazione supplementare è necessaria,
in quanto trattasi di soggetti regolarmente assisiti
presso l’Azienda Ospedaliera Brotzu e in
quanto il prelievo di sangue verrà effettuato
in concomitanza con il prelievo per il dosaggio
degli anticorpi anti insula pancreatica richiesto
al paziente per il normale follow up clinico.
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Aspetti
etici e tutela della privacy
Le finalità e le modalità dello studio
verranno esposte verbalmente e per iscritto ai
partecipanti. Essi verranno resi edotti del fatto
che i rischi legati alla partecipazione allo studio
sono minimi e che nulla cambierà nella assistenza
prestata qualora essi decidessero di non prendere
parte allo studio. Tali rischi sono peraltro solo
quelli legati al prelievo di sangue a cui i pazienti
già si sottopongono periodicamente per i
monitoraggio clinico della malattia diabetica.
I dati sensibili e il materiale biologico verranno
raccolti esclusivamente previa firma di un consenso
informato da parte dei partecipanti (allegato).
Essi verranno utilizzati esclusivamente per gli
scopi dello studio in oggetto. Qualora ne facesse
richiesta, sarà possibile ottenere la distruzione
dei dati e dei campioni biologici relativi al soggetto
che abbandona lo studio.
La raccolta dei dati personali e la loro l’archiviazione
avverrà nel rispetto delle vigenti leggi
sulla tutela della privacy. I dati sensibili relativi
ai soggetti reclutati saranno archiviati e custoditi
presso la Unità Operativa di Diabetologia
dell’Azienda Ospedaliera Brotzu sotto la
responsabilità del primario Dr Marco Songini
e potranno essere scambiate tra le strutture collaboranti
allo studio allo scopo della buona riuscita dello
stesso. Le attività svolte presso la University
of Pittsburgh verranno svolte sotto la tutela del
comitato etico della suddetta università a
cui è stata sottoposta analoga approvazione.
Tutte le informazioni dei soggetti inseriti nello
studio potranno essere scambiate tra le strutture
collaboranti allo studio allo scopo della buona
riuscita dello stesso, e saranno trattate in modo
anonimo al momento della elaborazione per la valutazione
dei risultati.
I campioni ematici degli stessi soggetti, verranno
custoditi presso la Struttura Semplice Dipartimentale
di Microbiologia, Dipartimento Servizi Speciali
di Diagnosi e Cura dell’A.O.B. sotto la responsabilità del
direttore Dr Alessandro Palomba e, dopo essere
stati resi anonimi, verranno inviati ai laboratori
di competenza della University of Pittsburgh.
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