PROGETTO DIABFIN

PREDIZIONE GENETICA ED IMMUNOLOGICA
DEL DIABETE TIPO 1
NELLA POPOLAZIONE GENERALE IN SARDEGNA
PROGRAMMA DI RICERCA FINALIZZATA 2000
MINISTERO DELLA SANITA'
 
PREMESSA

II diabete mellito insulino dipendente o tipo 1 (DM tipo 1) è una patologia endocrina autoimmune ed è una delle malattie croniche più frequenti nell'infanzia e nell'adolescenza. I risultati degli studi effettuati negli ultimi 20 anni hanno chiaramente indicato che il DM tipo 1 è una malattia che si manifesta in soggetti geneticamente predisposti su cui agisce un fattore etiologico ambientale. Tale malattia si manifesta a causa della distruzione specifica e selettiva da parte del sistema immunitario delle cellule insulari pancreatiche producenti insulina, distruzione che lascia intatte le altre cellule delle isole del Langerhans. Il processo autoimmune si manifesta in individui geneticamente suscettibili e ha una durata variabile, da pochi mesi a molti anni, con un lungo periodo di latenza preclinico caratterizzato dalla presenza nel sangue periferico di autoanticorpi contro la beta cellula pancreatica.
Studi genetici, epidemiologici e immunologici hanno permesso di dividere la storia naturale del diabete di tipo 1 in varie fasi, a cominciare dalla suscettibilità genetica per terminare con l'esordio clinico della malattia con iperglicemia, glicosuria, insulino-dipendenza e tutte le altre anomalie metaboliche conseguenti al deficit insulinico.
Nel corso dei passati dieci anni, sono stati creati registri regionali dei nuovi casi di malattia ed identificato un certo numero di parenti di primo grado (fratelli e sorelle) considerati a rischio della stessa in quanto geneticamente predisposti e per la presenza di markers immunologici (autoanticorpi anti beta cellule). Grazie alla disponibilità dei markers immunologici è oggi possibile predire anche nella popolazione generale, tra coloro che sono geneticamente suscettibili, quei soggetti che svilupperanno il DM di tipo 1, in quanto è già iniziata l’aggressione autoimmune contro le beta-cellule, e mettere in opera quindi misure preventive.
Dal punto di vista patogenetico, i numerosi studi finora condotti hanno dimostrato che gli autoanticorpi non partecipano direttamente alla distruzione delle isole pancreatiche né nel diabete umano né nei modelli animali quali topo NOD e ratto BB, infatti la distruzione betacellulare è operata da linfociti T-citotossici. Tuttavia lo studio della risposta autoanticorpale nel diabete di tipo 1 ha contribuito in maniera fondamentale all'avanzamento delle conoscenze sull'origine, la predizione e la storia naturale di questa malattia.
Sotto il profilo epidemiologico i dati sinora raccolti indicano che l’incidenza del diabete tipo 1 in Sardegna (36.8/100.000/anno al di sotto dei 15 anni) non solo è decisamente più alta rispetto a quella registrata in altre regioni italiane (7-10/100.000/anno nella stessa fascia d’età) ma è oggi tra le più alte registrate a livello mondiale. Sebbene sia stata evidenziata una certa variabilità della distribuzione della malattia all’interno dell’isola, essa rimane comunque significativamente più alta rispetto alle altre regioni italiane.
Questi dati sono piuttosto allarmanti e, nonostante sia stata documentata una maggiore frequenza degli aplotipi HLA di suscettibilità genetica per lo sviluppo del diabete tipo 1, non sono stati individuati al momento fattori ambientali responsabili dell’inizio della aggressione autimmune contro le betacellule pancreatiche.
In Sardegna è stata segnalata anche una delle più alte prevalenze di malattia celiaca subclinica (10.4/1000 bambini in età scolare). Appare chiaramente evidente che la conduzione di uno screening genetico/immunologico in Sardegna offre le migliori garanzie per continuare non solo lo studio della storia naturale della fase preclinica del diabete tipo 1 ma anche per stabilire la presenza di un’eventuale relazione patogenetica tra la malattia celiaca e il diabete tipo 1.

Il marker genetico
I dati emersi da studi di popolazione e familiari e anche condotti nel topo NOD e nel ratto BB hanno dimostrato che il DM di tipo 1 ha una base patogenetica poligenica, con il coinvolgimento di numerosi geni situati sia nell'ambito sia al di fuori del sistema maggiore di istocompatibilità (MHC). Al momento sono stati identificati aplotipi HLA (particolarmente nella regione DR e DQ), i quali conferiscono una suscettibilità alla malattia particolarmente elevata (per questo chiamati IDDM1). Inoltre, studi di predizione condotti su parenti di 1° grado di soggetti con diabete di tipo 1 hanno dimostrato l'esistenza di alcuni alleli, quali ad esempio il DQB1*0602, che determinano invece una resistenza alla comparsa della malattia stessa. Più di recente sono stati identificati altri geni di suscettibilità al DM di tipo 1 quali la regione variabile del gene per l'insulina (denominato IDDM2) ed il CTLA-4 (denominato IDDM12), quest'ultimo particolarmente importante nella popolazione continentale italiana.
Tuttavia, nonostante i progressi cui si è di recente pervenuti nell'identificazione di tali geni, il marker genetico non può essere utilizzato da solo in quanto possiede un valore predittivo non molto elevato per essere di utilità clinica.
Inoltre la presenza in particolare di alcuni alleli dell'IDDM1 conferisce un rischio non indifferente anche per altre endocrinopatie autoimmuni tra cui in particolare quelle a carico della tiroide, del surrene e delle paratiroidi e la celiachia, da sole o associate (sindrome poliendocrina autoimmune).

Il marker immunologico
Autoanticorpi anti-isola pancreatica (ICA). Al momento, almeno tre diverse molecole sono state dimostrate quali antigeni bersaglio degli ICA: la GAD, la tirosina-fosfatasi insulare IA-2 e il ganglioside GM2-1.
Autoanticorpi anti-insulina (IAA). L'insulina è stata la prima molecola autoantigenica a essere identificata nel 1983 ben 9 anni dopo la scoperta degli ICA. Gli IAA vengono dosati mediante una metodica radioimmunologica competitiva in fase fluida.
Autoanticorpi anti-glutammico decarbossilasi (GAD). Autoanticorpi anti-GAD65 ed anti-GAD67 sono stati riportati in sieri di soggetti sia prima sia al momento della diagnosi di diabete. Tuttavia studi biochimici hanno chiaramente dimostrato che la GAD65 rappresenta l'isoforma immunodominante.
Autoanticorpi anti-tirosina fosfatasi insulare (IA-2). Studi biochimici più approfonditi hanno infine dimostrato che sia l'ICA512 sia le proteine di 37kD e di 40kD costituivano parte di due diverse isoforme di una tirosina fosfatasi insulare definite IA-2 e IA-2b. Autoanticorpi diretti contro entrambe queste isoforme sono altamente predittivi di una futura comparsa della malattia in parenti di 1° grado di soggetti con diabete di tipo 1.
Autoanticorpi anti-transglutaminasi tissutale. L’enzima transglutaminasi tissutale rappresenta l’autoantigene riconosciuto dagli anticorpi anti-endomisio nella malattia celiaca. La sua identificazione ha permesso di mettere a punto alcune metodiche di tipo radioimmunologico e immunoenzimatico che rilevano gli autoanticorpi diretti specificamente contro questo autoantigene. La determinazione di questi autoanticorpi rappresenta oggi la più valida ed economica alternativa, rispetto alle più indaginose determinazioni dei classici anticorpi anti-endomisio con immunofluorescenza indiretta, per eseguire uno screening di popolazione la malattia celiaca.
 
PROGRAMMA COMPLESSIVO

Obiettivo dello studio

Consiste nell'individuare - attraverso uno screening genetico prima, immunologico e metabolico poi – i soggetti a rischio per DM tipo 1 ed per altre patologie endocrine autoimmuni nella popolazione generale, al fine di poter eseguire in futuro un programma di prevenzione primaria di tali condizioni morbose.
Tale screening verrà condotto in Sardegna in una coorte di 2500 neonati, reclutati in 4 servizi di neonatologia. I dati genetici ed immunologici raccolti capillarmente nella popolazione sarda daranno la possibilità di identificare nuove ed efficaci strategie predittive da estendere a tutta la popolazione generale italiana ed offriranno il supporto per la ricerca dei fattori ambientali coinvolti nell’isola nei meccanismi patogenetici dell’autoimmunità.
Più dettagliatamente lo studio si propone di:
  • Definire la percentuale di neonati sardi a rischio genetico aumentato per lo sviluppo di diabete tipo 1
  • Valutare la frequenza di comparsa di anticorpi specifici per il diabete tipo 1 e per la malattia celiaca nel primo anno di vita.
  • Valutare le interazioni tra fattori ambientali nel primo anno di vita (raccolti tramite questionario) e comparsa dei marcatori immunologici
  • Valutare la distribuzione geografica dei marcatori genetici ed immunologici per il diabete tipo 1 all’interno della Sardegna
 
Metodologia
  • Screening per i markers genetici di suscettibilità al DM tipo 1 da eseguirsi alla nascita in 2.500 neonati sardi, prevedendo l’identificazione di circa 50 soggetti (2%) geneticamente a rischio elevato, 400 soggetti (18%) a rischio moderato e 2050 (80%) a basso rischio per DM tipo 1. Inoltre un terzo dei soggetti esaminati risulterà a rischio anche per celiachia.
  • Verranno effettuati prelievi di sangue dal cordone ombelicale al momento del parto. Sul DNA estratto dal sangue cordale verrà eseguita la tipizzazione degli alleli HLA di suscettibilità al DM tipo 1. Con tale metodologia verrà identificato il 20-25 % della popolazione a rischio per DM di tipo 1 (identificata per la presenza di aplotipi HLA di alto e moderato rischio per T1D). La restante quota, a basso rischio, non sarà più seguita in quanto la sua possibilità di sviluppare la malattia è mediamente piuttosto bassa. Si stima che nell'ambito della popolazione ad alto rischio, il 5% contrarrà il DM tipo 1 entro 15 anni di età, mentre in quella a rischio moderato solo lo 0.8% svilupperà la malattia.
  • È noto che la presenza dei marker autoanticorpali (più di un autoanticorpo) rappresenta un ulteriore marcatore di rischio per DM tipo 1. I soggetti risultati a rischio elevato o moderato allo screening genetico verranno studiati a distanza di un anno per la ricerca dei markers immunologici (autoanticorpi anti-beta cellule) al fine di identificare i bambini che sono sia a rischio genetico che immunologico e valutare le differenze rispetto ai bambini a rischio esclusivamente genetico.
  • Nel gruppo dei bambini a rischio sia genetico che immunologico verranno inoltre eseguiti tests metabolici-funzionali della beta cellula (test al glucagone) al fine di svelare l'esistenza di una iniziale alterazione secretiva. In tal modo sarà possibile instaurare protocolli di terapia preventiva che includono l'induzione della tolleranza immunologica e l'impiego di sostanze in grado di prevenire il danno pancreatico, come la nicotinamide o l'insulina stessa.
Uno studio analogo con lo stesso disegno sperimentale e le medesime finalità è già operativo in Italia continentale nelle regioni Lazio, Lombardia e Liguria da un anno ed inizia a fornire i primi dati di fattibilità da un punto di vista organizzativo e gestionale accanto ad interessanti risultati di carattere scientifico.
 

Dimensione campionaria
La dimensione campionaria dei neonati sardi su cui condurre lo screening genetico (2500) è stata calcolata sulla base del tasso di nascita presente presso le unità che partecipano allo studio (circa 1000 neonati/anno/centro) e sulla precedente esperienza fatta in 3 province dell’Italia continentale (Genova, Milano, Roma) in cui il tasso di arruolamento è stato del 65-70% rispetto al numero complessivo di nascite. Questi dati consentono di stimare il completamento dell’arruolamento dei neonati in Sardegna entro i primi 12 mesi dall’avvio del progetto.
La dimensione del campione di studio garantisce la numerosità sufficiente per verificare eventuali differenze nella distribuzione delle classi rischio genetico tra le province sarde e permetterà di quantificare le differenze nella distribuzione del rischio genetico presente in Sardegna rispetto a quello presente nelle 3 province dell’Italia continentale precedentemente studiate.
 

Metodologia statistica Diabfin
Il test del Chi-Quadrato il Fisher exact test, quando richiesto, verranno utilizzati per testare le differenze delle frequenze nell’ambito di diversi gruppi. Il test T e l’analisi di varianza verranno impiegate per il confronto delle variabili quantitative tra i diversi gruppi. L’analisi non parametrica di Mann-Whitney e di Kruskall-Wallis verrà impiegata per il confronto delle variabili quantitative distribuite asimmetricamente rispetto alla curva di normalità.
L’influenza del tipo di rischio genetico e di altre variabili (anagrafiche, ambientali, cliniche) sul timing di comparsa degli autoanticorpi (sia all’interno dei bambini sardi che in quelli dell’Italia continentale) verranno valutati mediante l’analisi di Kaplan-Meyer e la Regressione di Cox.
 
DURATA DEL PROGETTO

Il progetto avrà la durata complessiva di 2 anni. L'implementazione degli studi clinici di prevenzione della malattia potrà avere inizio alla fine del secondo anno una volta identificato un numero sufficiente di individui.
Esso è finanziato dal Ministero della Sanità.
 
FASI DEL PROGETTO DI RICERCA

Fase di arruolamento
Tutte le madri verranno invitate a partecipare al progetto nel momento in cui si ricoverano per il parto. Verrà raccolto un consenso informato e, successivamente, verrà compilato uno specifico questionario anamenestico. Al momento del parto verranno raccolte dal cordone ombelicale un’aliquota di 4 ml di sangue intero in EDTA e un’aliquota di siero 2 ml che verranno immediatamente stoccate a –20°C. Al momento della dimissione della madre e del figlio, sarà loro consegnata una lettera informativa per il Pediatra Curante del bambino per informarlo del progetto in atto. Tutti i campioni di sangue intero in EDTA verranno spediti a scadenza trimestrale al centro di tipizzazione genetica.
L’arruolamento verrà condotto nei 4 servizi di neonatologia/ostetricia che hanno accettato di partecipare al progetto
  • Clinica Universitaria Macciotta - Cagliari
  • Ostetricia e nonatologia Ospedale Brotzu – Cagliari
  • Neonatologia Ospedale S. Martino – Oristano
  • Neonatologia Ospedale S. Francesco - Nuoro

Studio del marker genetico.
Il DNA estratto dal sangue verrà impiegato inizialmente per la tipizzazione HLA utilizzando 21 'probes' in grado di identificare alleli ritenuti a rischio per DM tipo 1 e malattia celiaca. Si stima che il 25-30% dei soggetti esaminati avrà un rischio moderato o elevato per una di queste patologie.
I campioni verranno conservati a -20°C fino al momento della tipizzazione genetica.
La tipizzazione genetica verrà effettuata nel laboratorio del CNR di Alghero – prof. M. Pirastu
Fase di Follow up

Studio dei markers immunologici.
Tutti i bambini che risulteranno a rischio genetico aumentato verranno richiamati all’età di un anno per la valutazione della comparsa dei marcatori autoanticorpali di rischio per diabete tipo 1 e malattia celiaca. La comunicazione del rischio verrà fatta ai genitori sia telefonicamente che per lettera. In tale occasione i genitori verranno invitati a presentarsi presso il Centro di arruolamento con il loro bambino. Essi verranno invitati a continuare la partecipazione allo studio acconsentendo al prelievo di un campione di sangue del bambino per il dosaggio dei marcatori autoanticorpali e alla raccolta di un’accurata anamnesi specifica relativa al primo anno di vita. Tutti i campioni raccolti verranno analizzati dall’unità centrale preposta entro 3 mesi dal prelievo.
I campioni verranno conservati in freezer a –20°C fino al momento dell’analisi.
La determinazione degli autoanticorpi anti insula pancreatica verrà effettuata presso il laboratorio dell’Ospedale S. Raffaele di Milano – Prof. Bosi dotato di notevole esperienza nel campo e inserito nei recenti workshop sugli autoanticorpi anti insula pancreatica.
Studio del marker metabolico.
I bambini positivi per almeno un anticorpo verranno sottoposti ad un secondo prelievo per confermare tale positività. Se ciò verrà confermato si inviteranno a partecipare allo studio metabolico della secrezione insulinica (test al glucagone con dosaggio di insulina, del C-peptide e della glicemia nei campioni di plasma ottenuti) o se positivi per Ab anti transglutaminasi alla biopsia della mucosa digiunale per eventuale diagnosi di malattia celiaca.
Questi esami verranno effettuati negli stessi ospedali in cui si svolge lo screening
  • Clinica Universitaria Macciotta - Cagliari
  • Diabetologia Ospedale Brotzu – Cagliari
  • Pediatria Ospedale S. Martino – Oristano
  • Pediatria Ospedale S. Francesco - Nuoro
RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEL MATERIALE RACCOLTO
I dati raccolti da ogni neonato durante l’indagine (anamnestici, clinici, immunologici, genetici) verranno utilizzati esclusivamente per gli scopi della ricerca proposta. La raccolta e la archiviazione dei dati personali e del materiale genetico avverrà nel rispetto delle vigenti leggi sulla tutela della privacy. I dati sensibili saranno archiviati e custoditi presso le unità di screening e presso il centro di coordinamento sardo: Unità Operativa di Diabetologia – Azienda Ospedaliera Brotzu. I dati saranno archiviati in forma cartacea ed informatizzati in un apposito database. Tutte le informazioni e i campioni ematici dei soggetti inseriti nello studio saranno trattati in modo del tutto anonimo dai laboratori e al momento della elaborazione per la valutazione dei risultati. Ad ogni neonato verrà attribuito un codice identificativo personale, che codificherà il centro di nascita e il numero progressivo di arruolamento. I dati verranno mensilmente aggiornati e verificati per assicurane l’accuratezza e l’attendibilità. L’integrazione dei dati raccolti e la loro gestione è affidata ai centri di coordinamento regionale (Ospedale San Michele) e nazionale (Ospedale Pediatrico Bambino Gesù) del progetto.
 
TEMPI
La fase di arruolamento sarà completata nel primo anno mentre la fase di follow up verrà portata a termine nel periodo previsto di due anni, tenendo conto che le indagini immunologiche inizieranno nei soggetti geneticamente predisposti appena identificati come tali e già nel corso del primo anno del progetto.
 
PRODOTTO FINALE DEL PROGETTO

II prodotto finale di questo progetto consiste nell'identificazione di bambini ad elevato rischio di sviluppare il DM tipo 1 e di altre patologie endocrine autoimmuni ad esso associate. Sarà possibile identificare, per la prima volta nella popolazione generale sarda, i bambini con marcatori di rischio sia genetico che immunologico per DM tipo 1 e per altre malattie a patogenesi autoimmune. Ciò permetterà di monitorare nel tempo tali individui, attraverso l’esecuzione di tests sia immunologici che metabolici, che ci consentirà di intervenire tempestivamente con terapia appropriata ancora prima della comparsa del quadro clinico conclamato. Ciò potrà essere realizzato facilmente nel caso della malattia celiaca, mentre per quanto riguarda il DM tipo 1 gli approcci sono ancora in fase di sperimentazione.
Visti i costi che queste condizioni morbose comportano una volta che si sono instaurate, la prevenzione del DM tipo 1 e di altre patologie autoimmuni endocrine ad esso associate potrebbe determinare un risparmio stimabile in 5 miliardi, qualora la prevenzione ottenuta si limitasse anche solo a 10 soggetti, con un evidente beneficio sui costi, peraltro già elevati, del SSN.
 
CENTRI PARTECIPANTI
i
Coordinamento in Sardegna:
· U.O. di Diabetologia – Azienda Ospedaliera Brotzu – Cagliar
Dr Marco Songini
Dr.ssa Roberta Pisano
 
 
  Unità di screening:
· Neonatologia e Ostetricia Ospedale Brotzu – Cagliari
    Dr.ssa Luciana Pibiri – Dr Paolo Masile
Dr Raffaele Puddu – Dr.ssa Esmeralda Loi
Dr.ssa Roberta Pisano
  · Pediatria Ospedale S. Martino - Oristano
    Dr Giovanni Zanda, Dr.ssa M. Grazia Serra
  · Neonatologia Clinica Universitaria Macciotta – Cagliari
    Prof Adriano Corrias, Dr.ssa Francesca Pinna
· Pediatria Ospedale S. Francesco – Nuoro
    Dr.ssa Anna Franca Milia, Dr.ssa Rossanella De Guio