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  A PROTEOMICS APPROACH FOR STUDYING HUMORAL AUTOIMMUNITY IN LATENT AUTOIMMUNE DIABETES OF ADULTHOOD (LADA)
Il diabete mellito rappresenta un gruppo eterogeneo di malattie metaboliche caratterizzate da iperglicemia derivante da un difetto della secrezione insulinca, dell’azione dell’insulina o di entrambe. L’autoimmunità contro le b-cellule, che è caratteristica del diabete tipo 1A è presente nel 10-15% dei soggetti clinicamente diagnosticati come affetti da diabete tipo 2. Nell’UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) si è notato che tra i pazienti con diabete tipo 2, la presenza di autoanticorpi contro la decarbossilasi dell’acido glutammico (GADA) e di anticorpi contro il citoplasma delle cellule delle insulae pancreatiche (ICA) è predittiva dello sviluppo di insulino-dipendenza rispetto a coloro i quali non presentano la positività per tali autoanticorpi. Se la risposta autimmune contro le cellule insulari è realmente presente nel 10-15% dei soggetti clinicamente diagnosticati come affetti da diabete tipo 2, fino a 2 milioni di americani potrebbero avere una forma di diabete autoimmune non correttamente diagnosticata, una prevalenza simile a quella rilevata nei bambini.
La ricerca oggetto del presente studio avrà quindi lo scopo di identificare nuovi epitopi contro cui si dirige la risposta autoimmune b-cellulare e che potrebbero partecipare al meccanismo di attivazione o perpetuazione di tale risposta autoimmune nei pazienti affetti da LADA, mediante l’applicazione di nuove metodiche di proteomics su sieri provenienti da pazienti sardi caratterizzati come LADA (Latent Autoimmune Diabetes of the Adult). Essa verrà condotta in Sardegna presso la Struttura Complessa di Diabetologia e la Struttura Semplice Dipartimentale di Microbiologia, Dipartimento Servizi Speciali di Diagnosi e Cura dell’Azienda Ospedaliera Brotzu di Cagliari e negli USA presso la Division of Immunogenetics, Diabetes Institute, University of Pittsburgh School of Medicine, PA.
Obiettivi
Lo scopo principale della proposta di studio è quindi quello di identificare nuovi target molecolari della autoimmunità nei pazienti sardi affetti da LADA. Gli anticorpi contro questi determinanti molecolari potrebbero in futuro essere utilizzati a scopo diagnostico, oltre a consentire una migliore comprensione della patogenesi del LADA.
Risultati preliminari ottenuti presso il laboratorio della Division o Immunogenetics di Pittsburgh da studi condotti con la medesima tecnologia di proteomics, hanno identificato due proteine candidate ad essere marcatori della risposta autoimmune contro le insulae pancreatiche. Il cDNA umano corrispondente alle due proteine identificate, verrà successivamente clonato e ne verrà valutata la rilevanza per lo sviluppo del diabete autoimmune mediante tecniche di immunoprecipitazione, utilizzando proteine sintetizzate in vitro come sorgente dell’antigene. Le proteine candidate verranno poi sottoposte ad ulteriori analisi strutturali. L’obiettivo finale sarà quindi quello di aumentare la specificità e il valore predittivo delle metodiche di misurazione degli autoanticorpi nella fase preclinica del diabete allo scopo di migliorare la sensibilità e specificità nel rilevare la malattia nei pazienti affetti da LADA.
Razionale dello studio
La Sardegna rappresenta un modello per studiare il diabete Tipo 1 e le altre malattie autoimmuni. Essa presenta un isolamento geografico e una popolazione relativamente piccola (di 1,6 milioni di abitanti) che la rendono ottimale per la conduzione di questi studi. La popolazione sarda è inoltre geneticamente omogenea e presenta numerose peculiarità genetiche, culturali e linguistiche dovute al lungo isolamento, al piccolo numero di fondatori e alla pressione di fattori di selezione come ad es la malaria. Per questo motivo in Sardegna sono particolarmente frequenti alcune malattie geneticamente determinate caratterizzate da mutazioni peculiari nell’isola (talassemia, malattia di Wilson, APECED) come anche numerose malattie autoimmuni (diabete tipo 1, celiachia, sclerosi multipla). Nonostante la elevata incidenza del diabete tipo 1 nei bambini, la seconda più alta al mondo, dati preliminari riguardanti la prevalenza di LADA nel nord dell’isola, definito come diabete di tipo 2 con positività per i GADA, ha mostrato essere simile a quanto descritto in altri paesi.
Per quanto riguarda in particolare il diabete autoimmune, gli anticorpi circolanti sono stati studiati in modo estensivo nei bambini come markers diagnostici della fase preclinica della malattia. La specificità per la malattia e il valore predittivo di questi marcatori anticorpali hanno ormai raggiunto un livello di precisione tale che una combinazione di essi è in grado di identificare i soggetti ad alto rischio di sviluppare la malattia tra i parenti di primo grado di soggetti diabetici di tipo 1. Al contrario, poco o nulla si sa in merito alla risposta immune umorale nei LADA, né per quale motivo tali individui non sviluppino precocemente insulino dipendenza, e a tutt’oggi la diagnosi di LADA viene fatta solo sulla base della presenza di GADA o ICA nel siero dei pazienti diabetici. La presenza di multipli anticorpi diretti contro le insulae pancreatiche ha dimostrato essere un importante indice di predizione del successivo sviluppo della malattia clinica. Infatti, in base alle conoscenze attuali, nei pazienti con LADA, gli ICA e i GADA sembrerebbero essere i principali markers associati con l’insulino-dipendenza, mentre numerosi ricercatori hanno rilevato frequenze di IA2 così basse da non rendere tale marcatore utile in questa categoria di pazienti. Non è tuttavia chiaro se siano presenti nel LADA altri marcatori autoanticorpali. E’ da notare che alcuni studi pubblicati e dati non pubblicati ottenuti dall’UKPDS hanno mostrato che un certo numero di pazienti con LADA sono positivi per ICA ma non per GADA o IA2. Risultati preliminari a supporto di ciò sono stati ottenuti anche presso la Division of Immunogenetics di Pittsburgh su pazienti con diabete tipo 1 di età superiore ai 17 anni. Si è infatti rilevata positività per ICA nel 52% (34/65) dei pazienti affetti da diabete tipo 1 che erano negativi per IA2 e GADA, segno quindi che altri antigeni diversi dalla GAD e dall’IA2 contribuiscono alla positività all’immunofluorescenza degli ICA.
In base a quanto precedentemente esposto, appare quindi necessaria l’individuazione di nuovi marcatori immunologici diretti contro specifici autoantigeni nei LADA.
Ogni nuovo marcatore potrebbe infatti fornire nuovi elementi per la comprensione della eziologia della malattia e della sua progressione. L’identificazione di nuovi autoantigeni consentirà poi la nascita di studi sulla patogenesi della malattia e sulla tolleranza immunologica, che potranno quindi essere utili per un futuro sviluppo di terapie preventive, poiché esistono numerose evidenze a supporto del fatto che un precoce intervento nella fase preclinica potrebbe consentire una prevenzione della malattia diabetica o almeno un ritardo nella sua insorgenza.
La scoperta di nuovi marcatori anticorpali nel LADA, quindi, aumenterà la capacità predittiva dei marcatori attualmente disponibili soprattutto nella popolazione generale, dove le nostre capacità di individuare i soggetti a rischio di sviluppare il diabete tipo 1 sono molto più ridotte di quanto non siano per i familiari di primo grado dei soggetti diabetici. Inoltre questi nuovi marcatori potrebbero rappresentare degli indici di velocità di progressione della malattia verso la fase clinica, soprattutto nel caso in cui siano specifici per il LADA, caratterizzato da un esordio tardivo e da un più lento declino della funzione b-cellulare rispetto al diabete tipo 1 “classico”. Essi potrebbero inoltre essere utili per valutare l’eventuale successo di un trapianto di insulae. La disponibilità delle sequenze proteiche dei nuovi antigeni e la possibilità di sintetizzarle in vitro stimolerà inoltre la nascita di studi per la comprensione della patogenesi della malattia e della tolleranza in animali da esperimento, o nello studio della risposta T-cellulare.
Risultati preliminari
Alcuni risultati preliminari sono stati prodotti recentemente presso il Department of Immunogenetics dell’University of Pittsburgh sui sieri di 16 diabetici di tipo 1 e 18 controlli non diabetici. Tecniche di Western Blotting e di impregnazione argentica hanno mostrato l’elettiva reattività dei sieri dei diabetici con alcune particolari frazioni proteiche delle insulae pancreatiche. Il confronto con le librerie dell’NCBI e del Expasy Protome Website consentirà di individuare in quale punto della mappa proteomica vengono visualizzate le nuove proteine reattive individuate e di differenziarle da quelle contro cui reagiscono gli autoantigeni delle b-cellule già noti, favorendone la caratterizzazione.
Scopi specifici
1)
identificare le proteine autoreattive nelle b-cellule nei pazienti con LADA mediante l’applicazione delle tecniche di proteomics.
2)
Identificare la sequenza cDNA delle proteine candidate allo scopo di ottenere un cDNA completo utilizzando 5’RACE o una library di espressione del cDNA delle cellule insulari
3)
Clonare le molecole o i domini all’interno di vettori di trascrizione/traduzione in vitro e costruire un radioimmunoassay simile a quelli attualmente in uso per il dosaggio di GADA e IA2
Gli scopi elencati precedentemente verranno sviluppati utilizzando i sieri ottenuti da una coorte di pazienti LADA sardi.
Gruppi collaboranti allo studio
Organizzazione ed amministrazione

Il presente studio sarà condotto in collaborazione tra le seguenti strutture e personale con le funzioni di seguito indicate:
· Struttura Complessa di Diabetologia – Azienda Ospedaliera Brotzu di Cagliari – Italia
o
oDr. Marco Songini – Direttore
o
oDr.ssa Anna Casu
o
oPersonale medico e infermieristico che potrà secondo le necessità collaborare alla raccolta dei campioni dei pazienti LADA
Tale struttura svolgerà principalmente il compito di raccolta dei campioni di siero dei pazienti e dei controlli e di caratterizzare da un punto di vista clinico i pazienti, l’archiviazione dei dati personali e clinici dei pazienti e l’archiviazione dei sieri, a cui si affiancherà la discussione scientifica sui risultati ottenuti
· Struttura Semplice Dipartimentale di Microbiologia, Dipartimento Servizi Speciali di Diagnosi e Cura dell’Azienda Ospedaliera Brotzu di Cagliari – Italia
o
o Dr. Alessandro Palomba – Direttore
o
o Dr. Marco Liguori
Tale struttura avrà il compito di effettuare il dosaggio di ICA, GADA e IA2 necessari per la identificazione dei soggetti LADA e dei controlli, a cui si affiancherà la discussione scientifica sui risultati ottenuti.
· Struttura Complessa Centro Trasfusionale - Azienda Ospedaliera Brotzu di Cagliari – Italia
o
o Dr. Michele Bajorek - Direttore - e suoi collaboratori
Tale struttura avrà il compito di raccogliere i campioni dei controlli sani necessari per la valutazione della specificità e sensibilità dei test immunologici messi a punto
· Department of Immunogenetics – University of Pittsburgh School of Medicine – Pittsburgh, PA, US
o
o Prof. Massimo Pietropaolo e suoi collaboratori
Presso i cui laboratori verranno eseguiti gli studi di ricerca e caratterizzazione dei nuovi marcatori autoanticorpali. I sieri e le informazioni cliniche dei pazienti verranno quindi trasferiti a questo centro in modo anonimo. A ciò si affiancherà la discussione scientifica sui risultati ottenuti.
Popolazione da studiare
Criteri di inclusione e di esclusione
· Soggetti LADA definiti come soggetti diabetici:
o
o Positivi per autoanticorpi anti insula pancreatica (ICA, GADA e/o IA2)
o
o Diagnosticati ad un’età uguale o superiore ai 40 anni
o
o Se diagnosticati ad un’età inferiore a 40 anni, non insulinodipendenti per almeno 1 anno dalla diagnosi. La insulino indipendenza verrà giudicata sulla base del controllo glicometabolico.
· Soggetti di controllo diabetici di tipo 2 negativi per autoanticorpi antiinsula pancreatica. La selezione di questo gruppo di soggetti di controllo consentirà di escludere che i marcatori eventualmente rilevati siano da correlare alla alterazione del metabolismo glucidico piuttosto che al fenomeno autoimmune in sé.
· Soggetti di controllo sani di pari età.
· Soggetti di controllo affetti da diabete tipo 1 con esordio “classico” per eventualmente poter identificare dei marcatori specifici per il LADA piuttosto che per il diabete autoimmune in generale.
La numerosità della popolazione da studiare, in particolare la numerosità dei controlli, dipenderà dal numero di LADA che sarà possibile individuare. Sulla base del numero di diabetici tipo 2 seguiti regolarmente presso la Struttura Complessa di Diabetologia della AOB e sulla base dei dati di letteratura sulla prevalenza di LADA tra i pazienti affetti da diabete tipo 2, si stima di poter reclutare fino ad un massimo di 500 pazienti con LADA.
Metodiche da applicare:
Prelievo di sangue
La ricerca dei nuovi marcatori immunologici verrà effettuata su campioni di siero del paziente.
I pazienti verranno inclusi nello studio al momento in cui il medico diabetologo riterrà opportuno sottoporli alla ricerca degli anticorpi anti insula pancreatica nell’ambito della normale attività di follow up clinico. In tale occasione verrà raccolto il campione di siero necessario per lo studio dopo la firma del consenso informato da parte del paziente.
Presso la Struttura Semplice Dipartimentale di Microbiologia, Dipartimento Servizi Speciali di Diagnosi e Cura dell’A.O.B. sono stati conservati i campioni di siero dei soggetti che hanno eseguito il prelievo per il dosaggio degli anticorpi anti insula pancreatica (ICA, GADA e IA2). La determinazione di tali autoanticorpi è stata solo recentemente inserita nel pannello degli esami praticati presso la A.O.B. e i campioni di siero sono stati conservati a maggiore tutela della qualità dei risultati ottenuti. Dopo l’esecuzione dell’esame il campione di siero è stato congelato e conservato alla temperatura di -20°. Tali sieri potrebbero essere agevolmente utilizzati per il presente studio, dopo firma da parte del paziente del modulo di consenso informato, evitando di sottoporre il paziente stesso ad un nuovo prelievo.
Raccolta del consenso informato
Il consenso informato al prelievo (come da modulo allegato) potrà essere firmato al momento della prescrizione del dosaggio degli anticorpi anti insula o al momento del prelievo.
I pazienti di cui è già disponibile il siero verranno invece ricontattati telefonicamente e verrà loro proposto di partecipare allo studio e di firmare il consenso informato (come da modulo allegato) in occasione della successiva visita diabetologica o in occasione di un appuntamento fissato a tale scopo. Si prenderanno tutti gli accorgimenti per creare al paziente il minor disagio possibile.
Conservazione dei sieri
I campioni di sangue ottenuti verranno sottoposti a sieratura secondo le normali procedure e aliquotati per poi essere conservati in freezer a -20° fino al momento del dosaggio.
Le aliquote di siero verranno identificate con un numero di sieroteca che sarà l’unico elemento che consentirà la identificazione della appartenenza del siero ad un particolare individuo. Tale numero sarà riportato sul database di registrazione dei soggetti.
I campioni ematici degli stessi soggetti, verranno custoditi presso la Struttura Semplice Dipartimentale di Microbiologia, Dipartimento Servizi Speciali di Diagnosi e Cura dell’A.O.B. sotto la responsabilità del direttore Dr Alessandro Palomba e verranno analizzati presso i laboratori del Department of Immunogenetics della University of Pittsburgh.
Raccolta delle informazioni clinche
Una volta ottenuto il campione di sangue e il consenso del paziente, si procederà alla registrazione su apposito database informatico dove saranno registrate le informazioni cliniche relative al soggetto e quelle necessarie alla classificazione clinica del tipo di diabete. Queste informazioni verranno desunte da quanto riportato sulla cartella clinica di ciascun paziente seguito presso la S.C. di Diabetologia della A.O.B., senza quindi arrecare ulteriore disagio al paziente con la raccolta dei dati anamnestici.
Comunicazione al paziente dei risultati dei dosaggi effettuati
Il risultato del dosaggio di ICA, GADA e IA2 verrà comunicato al paziente dal medico diabetologo che ha richiesto l’esame secondo le normali procedure previste dalla assistenza clinica diabetologica applicate dalla S.C. di Diabetologia. Non sarà invece possibile comunicare al paziente i risultati della ricerca dei nuovi marcatori sul suo sangue, poiché nulla si sa al momento della validità di questi eventuali nuovi marcatori. Il paziente verrà informato di ciò.
Database
Le informazioni personali, anamnestiche, cliniche e relative al prelievo, verranno registrate su un database informatizzato creato appositamente. Tali informazioni saranno inoltre periodicamente (mensilmente) stampate sotto forma di report ed archiviate anche in forma cartacea allo scopo di preservare i dati da qualsiasi possibile incidente che possa avvenire al database. Verrà inoltre periodicamente (mensilmente) eseguita una copia di back up su CD.
Il database sarà custodito presso la S.C. di Diabetologia della AOB sotto la responsabilità del dr Marco Songini. Le informazioni in esso contenute potranno essere scambiate tra le strutture collaboranti allo studio allo scopo della buona riuscita dello stesso.
Ricerca dei marcatori
Le metodiche di laboratorio da applicare per la ricerca dei nuovi marcatori sono descritte nella appendice.
Lo sviluppo finale della metodica di radioimmunoassay per il dosaggio degli autoanticorpi contro le proteine individuate sarà analogo a quello attualmente in vigore per il dosaggio degli altri autoanticorpi anti insula pancreatica IA2, GADA, IAA per i quali il laboratorio del Department of Immunogenetics della University of Pittsburgh School of Medicine ha una provata esperienza.
Analisi statistica
Dopo aver clonato le proteine che reagiscono con i sieri dei pazienti LADA, verrà prodotta la Reciver Operating Characteristic (ROC) Curve per ciascun test di laboratorio mettendo in grafico in ascissa il tasso di veri positivi (sensibilità) tra i pazienti LADA analizzati (almeno 250) e in ordinata il tasso di falsi positivi (1-specificità) ottenuto nei controlli (almeno 250). L’area sotto la curva verrà calcolata e la differenza rispetto al valore 0.5 (che indica la assenza di discriminazione tra diabetici e controlli) analizzata mediante il test z. Questo stesso approccio è stato utilizzato in passato per ottimizzare le metodiche di dosaggio degli anticorpi anti insula già noti.
Personale e mezzi coinvolti
Nessun onere aggiuntivo sarà dovuto dalla Azienda Ospedaliera Brotzu per lo svolgimento del protocollo di studio.
I fondi necessari per lo svolgimento dello studio saranno forniti dalla University of Pittsburgh School of Medicine. Ulteriori fondi potranno essere ottenuti da parte delle diverse società scientifiche.
Assicurazione
Nessuna assicurazione supplementare è necessaria, in quanto trattasi di soggetti regolarmente assisiti presso l’Azienda Ospedaliera Brotzu e in quanto il prelievo di sangue verrà effettuato in concomitanza con il prelievo per il dosaggio degli anticorpi anti insula pancreatica richiesto al paziente per il normale follow up clinico.
Aspetti etici e tutela della privacy
Le finalità e le modalità dello studio verranno esposte verbalmente e per iscritto ai partecipanti. Essi verranno resi edotti del fatto che i rischi legati alla partecipazione allo studio sono minimi e che nulla cambierà nella assistenza prestata qualora essi decidessero di non prendere parte allo studio. Tali rischi sono peraltro solo quelli legati al prelievo di sangue a cui i pazienti già si sottopongono periodicamente per i monitoraggio clinico della malattia diabetica.
I dati sensibili e il materiale biologico verranno raccolti esclusivamente previa firma di un consenso informato da parte dei partecipanti (allegato). Essi verranno utilizzati esclusivamente per gli scopi dello studio in oggetto. Qualora ne facesse richiesta, sarà possibile ottenere la distruzione dei dati e dei campioni biologici relativi al soggetto che abbandona lo studio.
La raccolta dei dati personali e la loro l’archiviazione avverrà nel rispetto delle vigenti leggi sulla tutela della privacy. I dati sensibili relativi ai soggetti reclutati saranno archiviati e custoditi presso la Unità Operativa di Diabetologia dell’Azienda Ospedaliera Brotzu sotto la responsabilità del primario Dr Marco Songini e potranno essere scambiate tra le strutture collaboranti allo studio allo scopo della buona riuscita dello stesso. Le attività svolte presso la University of Pittsburgh verranno svolte sotto la tutela del comitato etico della suddetta università a cui è stata sottoposta analoga approvazione.
Tutte le informazioni dei soggetti inseriti nello studio potranno essere scambiate tra le strutture collaboranti allo studio allo scopo della buona riuscita dello stesso, e saranno trattate in modo anonimo al momento della elaborazione per la valutazione dei risultati.
I campioni ematici degli stessi soggetti, verranno custoditi presso la Struttura Semplice Dipartimentale di Microbiologia, Dipartimento Servizi Speciali di Diagnosi e Cura dell’A.O.B. sotto la responsabilità del direttore Dr Alessandro Palomba e, dopo essere stati resi anonimi, verranno inviati ai laboratori di competenza della University of Pittsburgh.

Contatti segreteria

Sig.ra Monica Porceddu
E-Mail : asris@tin.it
Fax: 070 - 531947

Dove siamo

S.C. di Diabetologia
Azienda Ospedaliera Brotzu
Via Peretti 2 - 09134 - Cagliari

Donazioni

ASRIS – Onlus
Cc Bancario n. 003919431
ABI 02008
CAB 04814
Presso Banca Unicredit – Dip. Cagliari SD Sole

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